M- V -^ ^1^ ^^^■: ^n., ^ -'^'%. ■^- :>^ ^' , -e Ks^' i^P- ' ■ Je^^^ .'< >•<■=!.• JiS *^ ■'<, ^ ZEITSCHRIFT FÜR WISSENSCHAFTLICHE MIKROSKOPIE UND FÜR MIKROSKOPISCHE TECHNIK BEGRÜNDET VON Vf. J. BEHRENS Unter besonderer Mitwirkung von Prof. Dr. Paul Schieflferdecker und Dr. E. Sommerfeldt in Bonn in Tübingen herausgegeben von Dr. ernst Küster in Halle a. S. Band XXII (Jahrgang 1905) Mit 3 LichtdrucktHteln, 1 Steindrucktafel und -44: Holzsclmitten LEIPZIG Verlag von S. Hirzel 1905 Alle Rechte vorbehalten. X^ I n h a 1 1 s Y e r z e i c h n i s. I. Abhandlungen. Seite Ambronn, H. , Über pleochroitiscbe Silberkristalle und die Färbung mit Metallen 349 Arbeit, E., Der Leitzsche Universal-Projektions-Apparat 363 Arndt, G,, Beiträge zur Technik und Methodik der mikroskopischen Doppelsäge 104 Bödecker, C. F., Eine Entkalkungsmethode für Gewebe, welche wenig organische Substanz enthalten, in§be;^ondere Zahnschmelz . . 190 Cagnetto, G. , Per la colorazione delle cellule cromofile dell'Hypo- physis cerebri 539 Cristina, Di, Kuovo metodo per attaccare i tagli fatti da pezzi inclusi in celloidina 99 Fiorentini, P. , ed Siguer, M. , Su di un Metodo di Colorazione e Conservazione permanente del Sedimento urinario 187 Fischer, Alfr., Eine Sperrvorrichtung für mikroskopische Demon- strationen 100 Hansen, F. C. C, Über Eisenhämatein, Chromalaunhämatem , Ton- erdealaunhämatein , Hämateinlösungen und einige Cochenille- farblösuugen 45 Heidenhain, M., Die Trichloressigsäure als Fixierungsmittel. . . . 321 — , — , Über die Färbung von Knochenknorpel zu Kurszwecken'' . . 325 — , — , Über die Massenfärbung mikroskopischer Schnitte auf Glimmer- platten 330 — , — , Über die Anwendung des Azokarmins und der Chromotrope . 337 Henneberg, Neues Mikrotom von Leitz 125 Konaschko, P., Zur Technik der Injektion feiner Gefäße .... 179 Melissinos, K., Vorrichtung zur gleichzeitigen schnellen Färbung der auf Deckgläsern oder Objektträgern aufgeklebten Serienschnitte 130 IV Inhaltsverzeichnis. Seite Metz, C. , Die Leitzsche Dunkelfeldbeleuchtung bei Verwendung der homogenen Ölimmersion 114 Neumayer, L., Objektträgergestell zur Massenfärbung von auf- geklebten Paraffinschnitten 181 Pauly, Ant., Über eine einfache Methode zur Bestimmung der Brechungs- exponenten von Flüssigkeiten 344 Pavlow, AV., Kreosot als wasserentziehendes Mittel bei der Einbettung in Paraffin 18ß Peter, K., Der Anstrich der liichtebene 530 Richter, Osw. , Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie seit Zimmermanns „Botanischer Mikrotechnik" 194, 3G9 Ruzicka, VI., Zur Theorie der vitalen Färbung 91 Schneider, J., u. Just, J., Ultramikroskoi^ie der Uleosole .... 481 Schouten, S. L. , Reinkulturen aus einer unter dem Mikroskop iso- lierten Zelle 10 Siding, A., Ein Beitrag zur Paraffinschneidetechnik 177 Sommerfeldt , E. , Die mikroskopische Achsenwinkelbestimmung bei sehr kleinen Kristallpräparaten 356 Strehl, K., Mikroskopisches Experiment 192 — , — , Beugungsbild und Absorptionsbild 1 Triepel, H., Ein Zylinder -Rotations -Mikrotom 118 II. Referate. Abbe, E., Gesammelte Abhandlungen. Bd. IL (Wissenschaftliche Ab- handlungen aus verschiedenen Gebieten, Patentschriften, Ge- dächtnisreden) 544 Abrikossolf, A. J., Über die ersten anatomischen Veränderungen bei Lungenphthise 439 Albanese, N., Ein neuer Fall von Endotropismus des Pollenschlauches und abnormer Embryosackentwicklung bei Sibbaldia pro- cumbens L 299 Allen, Ch. E. , Nuclear division in the pollen mothercells of Lilium canadense 461 Arnold, J., Über Bau und Sekretion der Drüsen der Froschhaut ; zu- gleich ein Beitrag zur Plasmosomen-Granulalehre 286 Bab, H., Die Colostrumbildung als physiologisches Analogon zu Ent- zündungsvorgängen. Gleichzeitig ein Beitrag zur Lehre von den Leukocyten und deren Granulationen. Mit historischen Darlegungen 272 Backmund, K., Entwicklung der Haare und .Schweißdrüsen der Katze 285 Bäckström, H., Ein Kugelgranit von Spitzbergen 588 Inhaltsverzeichnis. V Seite Ballowitz, E., Die Riechzelien des Flußneunauges [Petrouiyzon Hu- viatilis] 160 Bartel, J.. u. Stein, R., Lymphdrüsenbau und Tuberkulose . . . 568 Baudi u. Simouelli, Über die Anwesenheit der Spirochaete pallida in sekundär syphilitischen Manifestationen und über die zu ihrem Nachweis angewendeten Fiirbungsmethoden 579 Beck V. Managetta, G., Über die Verwendung der Persio- Essigsäure zu mikroskopischen Tinktionen 166 Backe, F., Optische Untersuchungsmethoden 306 — , — , Messung des Winkels der optischen Achsen aus der Hyperbel- krümmung 464 Behrens, H. , Reaktionen für den mikrochemischen Nachweis organi- scher Basen 305 Berliner, K. , Beiträge zur Histologie und Entwicklungsgeschichte des Kleinhirns, nebst Bemerkungen über die Entwicklung der Funktionstüchtigkeit derselben 566 Björkenlieim, C. G., Beiträge zur Kenntnis des Pilzes in den Wurzel- anschwellungen von Alnus incana 300 Blumsteiu- Judina, B. , Die Pneumatisation des Markes der Vogel- knochen 560 Böhmer, C, Anleitung zur Untersuchung landwirtschaftlich wichtiger Stoffe. Zum Gebrauch in landwirtschaftlichen und agrikultur- chemischen Laboratorien und für die Praxis zusammengestellt und bearbeitet 545 Bösenberg, H. , Beiträge zur Kenntnis der Spermatogenese bei den Arachnoiden 426 Boit, H., Einfache und sichere Identifizierung des Typhusbacillus . . 572 Bordiert, M,, Über Markscheidenfärbung bei niederen Wirbeltieren . 153 Bürdet, J., Une methode de culture des microbes anaerobies . . . 454 Brand, F., Über die sogenannten Gasvakuolen und die differenten Spitzenzellen der Cyanophyceen, sowie über Schnellfärbung . 458 Braun, F., Einige Beobachtungen, die sich auf künstliche Doppel- brechung beziehen 302 — , — , Herstellung doppelt brechender Körper aus isotropen Bestand- teilen . 302 Über metallische Gitterpolarisation, insbesondere ihre Anwen- dung zur Deutung mikroskopischer Präparate 306 — , — , Der Hertz sehe Gitterversuch im Gebiete der sichtbaren Strahlung 306 Brauns, R., Mineralogie 304 Bredig, G., u. Schukowsky, G. v., Prüfung der Natur der flüssigen Kristalle mittels elektrischer Kataphorese 305 Brunnee, R., Polarisations -Mikroskoppolymeter 586 Bürker, K., Notiz über eine neue Form der Zählkammer .... 554 Buutiug, P. L., The Histology of Lymphatic Glands: the general Structure, the Reticulum and the Germ Centres 287 Cajal, S. R., Das Neurofibrillennetz der Retina 155 1 VI Inhaltsverzeichnis. Seite Cajal, S, R., siehe auch Ramön y Cajal, Cameron, J., The Development of the Retina in Amphibia, an Embryo- logical and Cytological Study 290 Cavalie, M., Les ramifications nerveuses dans Torgane electrique de la torpille (Torpedo Galvani) [Dispositif fibrillaire dans les gaines des fibres nerveuses et autour d'elles] 278 Chamberlain, Ch. J., Methods in Plant Histology 585 Claussen, P., Zur Entwicklung der Ascomyceten. Boudiera . . . 297 Courmont, J. , et Andre, Ch. , Technique histologique permettant de deceler sur les coupes les substances du groupe de la Purine, notamment l'acide urique 417 Degen, A., Untersuchungen über die kontraktile Vakuole und die Wabenstruktur des Protoplasmas 552 Depdolla, Ph., Untersuchungen über die Spermatogenese vom Lum- bricus terrestris 265 Doelter, C, Die Silikatschmelzen 463 Doerr, R., Beobachtungen über bazilläre Dysenterie 294 Dogiel, A. S., Der librilläre Bau der Nervenendapparate in der Haut des Menschen und der Säugetiere und die Neuronen- theorie 5G5 Donaggio, A., Colorazione positiva delle libre nervöse nella fase iniziale della degenerazione primaria e secondaria, sistematica or dififusa del sistema nervoso centrale 563 Donaldson, H. H., a. Hoke, G, W., On the Areas of the Axis Cilinder and meduUary Slieath as seen in cross Sections of the Spinal Nerves of Vertebrates 446 Donau, Über die Färbung der Boraxperle durch kolloidal gelöste Edelmetalle 304 Dreuw, Exstirpations- und Operationsfelder 137 Driesseu, L. F., Zur Glykogenfärbung 422 Dschiinkowsky, E., u. Luhs, S., Apparat zum sterilen Blutentnehmen zwecks Untersuchung 295 Dubreuil, G., Le Picro-Bleu, note sur l'emploi de ce reactif pour la coloration specifique des fibrilles conjonctives. Application ä l'etude du tissu reticule du ganglion lymphatique 420 Dworetzky, A. , Erfahrungen mit der Spengler sehen Formalin- methode zur Reinzüclitung von Tuberkelbazillen aus Bakterien- gemischen 450 Edens, Über Amyloidfärbung und Amyloiddegeneration 558 Ei'dely, A., Untersuchungen über die Eigenschaften und die Ent- stehung der Lymphe. Fünfte Mitteilung. Über die Beziehung zwischen Bau und Funktion des lymphatischen Apparates des Darmes 427 Ernst, A., Zur Kenntnis des Zellinhaltes von Derbesia 299 Ferguson, Margaret C. , Contributions to the knowledge of the life liistory of Pinus with special reference to sporogenesis, the development of the gametophytes and fertilization .... 583 Inhaltsverzeichnis. VII Seite Fernandez, M., Zur mikroskopischen Anatomie des Blutgefäßsystems der Tunikaten. Nebst Bemerkungen zur Phylogenese des Blutgefäßsystems im allgemeinen 142 Fichera, G. , Über die Verteilung des Glykogens in verschiedenen Arten experimenteller Glykosurie 288 Fischer, A., Die Zelle der Cyanophyceen 455 — , — , Eine neue Glykogenfärbung 421 Fischer, H. , Über die kolloidale Natur der Stärkekörner und ihr Verhalten gegen Farbstoffe. Ein Beitrag zur Theorie der Färbung 458 Fischler, F., Über die Unterscheidung von Neutralfetten, Fettsäuren und Seifen im Gewebe 262 Fleischer, B. , Beiträge zur Histologie der Tränendrüsen und zur Lehre von den Sekretgranula 162 Floyd, R., A contribution to tlie nervous cytology of Periplaneta Orientalis, the common cockroach 143 Gadzikiewicz, W., Über den feineren Bau des Herzens bei Malako- straken 141 Gaehtgens, W., Der Bacillus jasmino-cyaneus und der Bacillus flavo- aromaticus, zwei neue Farbstoff bildende Bakterien .... 293 Galli, G., Ein verbesserter Mischer zur Zählung der Blutkörperchen 148 Giemsa, G., Bemerkungen zur Färbung der Spirochaete pallida . . 576 — , — , Erwiderung zu vorstehenden Bemerkungen 578 — , — , Eine Vereinfachung und Vervollkommnung meiner Methylenazur- Methylenblau -Eosin -Färbemethode zur Erzielung der Roma- NOw^SKi-NocHT sehen Chromatinfärbung 449 Glas, E., Über intraepitheliale Drüsen, Cysten und Leukocytenhäufchen der menschlichen Nasenschleimhaut 286 — , — , Zur Frage der Sarkolyse. [Erste Mitteilung über quergestreifte Muskeln und deren Zerfallsprodukte im follikulären Gewebe der Tonsille] 427 Goldsteiu, K. , Untersuchungen über das Vorderhirn und Zwischen- hirn einiger Knochenfische [nebst einigen Beiträgen über Mittelhirn und Kleinhirn derselben] 565 Grabower, Die Verteilung und Zahl der Nervenfasern in den Kehl- kopfmuskeln und die Hinfälligkeit des Erweiterers der Stimmritze 279 Gräfe, V., Eine neue Reihe von Holzreaktionen 581 Groot, J. G. de, Ein neuer Kitt zum Schließen von Gefäßen mit Alkoholpräparaten auch für den Versand 136 Haane, G., Über die Cardiadrüsen und Cardiadrüsenzone des Magens der Haussäugetiere 567 Haberlandt, G, , Über die Plasmahaut der Chloroplasten in den Assimilationszellen von Selaginella Martensii Spring .... 584 Ralphen, G. , et Riche, A., Contribution k l'etude des teintures histologiques 546 Hansen, F. C. C, Untersuchungen über die Gruppe der Bindesub- stanzen. I. Der Hyalinknorpel 433 VIII Inhaltsverzeichnis. Seite Hai'desty, I., On the Development and Nature of the Neuroglia . . 157 Harz, C. O. , Amylum, Amj'lodextrin und Erythrodextrin in ihrem Verhalten gegen Chromsäure 459 Heinemann , Pli. , Untersuchungen über die Entwicklung des Meso- derms und den Bau des Ruderschwanzes bei den Ascidien- larven 424 Helber, E., Über die Zählung der Blutplättchen im Blute des Menschen und ihr Verhalten bei pathologischen Zuständen 150 — , — , Über die Entstehung der Blutplättchen und ihre Beziehungen zu den Spindelzellen 268 HeHer, O,, Die RoTHBERGERSche Neutralrotreaktion auf Gelatine bei 370 292 Herxheimer, K. , u. Hühner, H. , Über Darstellungsweise und Be- fund der bei Lues vorkommenden Spirochaete pallida . . . 575 Hinden, F., Neue Reaktionen zur Unterscheidung von Calcit und Dolomit 303 Hirschler, J., Weitere Regenerationsstudien an Lepidopterenpuppen [Regeneration des vorderen Körperendes] 265 Hlawatsch, C, Bestimmung der Doppelbrechung für verschiedene Farben an einigen Mineralien 302 Hoffendahl , K. , Beitrag zur Entwicklungsgeschichte und Anatomie von Poecilasma aurantium Daravin 144 Hus, Henri T. A., Spindle Formation in the PoUen-Mother-Cells of Cassia tomentosa B 582 Illing, G. , Vergleichende histologische Untersuchungen über die Leber der Haussäugetiere 436 — , — , Vergleichende makroskopische und mikroskopische Unter- suchungen über die submaxillaren Speicheldrüsen der Haus- säugetiere 284 — , — , Über einen eigenartigen Befund in den Glandulae vesiculares und den Glandulae ductus deferentis des Rindes 570 Imliof, G., Anatomie und Entwicklungsgeschichte des Lumbaimarkes bei den Vögeln 283 JoHy, J. , Recherches experimentales sur la Division indirecte des Globules rouges 148 Joris, H., Histogenese du Neurone 279 Kamou, K., Über die Geruchsknospen 161 Karakacheif, K. Iv., Über das Verhalten der Langerhans sehen Inseln des Pankreas bei Diabetes meUitus 435 Keinath, K. Th. , Über den mikroskopischen Nachweis von Fett in normalen Muskeln 145 Koch, A., Jahresbericht über die Fortschritte in der Lehre von den Gärungsorganismen 448 König, E., Über Badeplatten 413 Koii'ansky, Eugenie, Über eigentümliche Gebilde in den Leberzellen der Amphibien 288 Inhaltsverzeichnis. IX Seite Koi)sch, F., Über den Kern der Thrombocyten und über einige Methoden zur Einführung in das Studium der Säugetier- Thrombocyten 268 Kozowsky, A. D. , Zur Färbungsmethodik der Nervenfasern des Zentralnervensystems 277 Kral, F., Zur Difterenzierung und objektiven Darstellung des Zell- inhaltes von Hefe- und Spaltpilzen 296 — , — , Über einfache expeditive Geißelfärbungsmethoden 295 Kraus, A., Zur Färbung der Hyphomyceten im Horngewebe . . . 572 Krebs , P. , Die Nervenendigungen im Musculus stapedius mit be- sonderer Berücksichtigung der bei der Färbung angewandten Technik 280 Lams, H. , Contribution ä l'Etude de la Genese du vitellus dans rOvule des Teleosteens 16(3 Laß , M. , Beiträge zur Kenntnis des histologisch-anatomischen Baues des weiblichen Hundeflohes [Pulex canis Duges s. Pulex serraticeps Taschenbero] 425 Leake, H, M., The localization of the indigo-producing substance in indigo-pielding plants 461 Lehmann, 0., Flüssige Misch- und Schichtkristalle 303 Lenhossek, M. v., Ramöx y Cajals neue Fibrillenmethode . . . . 264 Lenzmann , R. , Über eine vereinfachte Methode der Färbung von Bluttrockenpräparaten 431 Lesage, Culture de l'amibe de la dysenteris des pays chauds . . . 140 Leyen, E. von der, Über die Schleimzone des menschlichen Magen- und Darmepithels vor und nach der Geburt 435 Liebreich, O., Über Blutkörperchenzählung mit dem Thoma-Zeiss- schen Apparat 554 Liudner,P., Mikroskopische Betriebskontrolle in den Gärungsgewerben mit einer,Einführung in die technische Biologie, Hefenreinkultur und Infektionslehre 135 London, E. S., Zur Lehre von dem feineren Bau des Nervensystems 447 Luczizky , W. , Über die Dispersion der optischen Achsen bei den rhombischen Pyroxenen 464 Lugiato, L., Degenerazioni secondarie sperimentali [da strappo dello sciatico] studiate col metodo di Donaggio per le degenerazioni — prima e seconda note 563 Mark, E. L., A paraffine bath heated by electricity 548 Merck, E., Prüfung der chemischen Reagentien auf Reinheit . . . 413 Meves, F., Zur Wirkung von Säure auf die roten Blutkörperchen der Amphibien 291 — , — , Über die Wirkung von Ammoniakdämpfen auf die roten Blut- körperchen von Amphibien 556 — , — , Über die Wirkung gefärbter Jodsäure auf die roten Blut- körperchen der Amphibien. Vorläufige Mitteilung 430 Meyburg , H. , Beitrag zur Kenntnis des Stadiums der „primären in toto konzentrischen" Knochenbildung 153 X Inhaltsverzeichnis. Seite Meyer, P., Ein Verfahren zur Erzielung haltbarer Amyloidpräparate 571 Michaelis, L., Ultramikroskopische Untersuchungen 423 Michniewicz, H. R., Über Plasmodesmen in den Kotyledonen von Lupinus-Arten und ihre Beziehung zum interzellularen Plasma 300 Miyake, K., Über Reduktionsteilung in den Pollenmutterzellen einiger Monokotylen 460 Möller, J. , Mikroskopie der Nahrungs- und Genußmittel aus dem Pflanzenreich 412 Molisch, H., Über amorphes und kristallisiertes Anthokyan .... 459 Mulon, P., Action de l'acide osmique sur les graisses 138 3Iyers, B. D., Fixation of tissues by injection into the arteries . . 555 Nabias , B. de , Nouvelle methode de coloration rapide du Systeme nerveux au chlorure d'or 139 Nicolle, F., Suite d'experiences relatives au phenomene de l'agglutina- tion des microbes 454 Noeggerath u. Staehelin, Zum Nachweis der Spirochaete pallida im Blut Syphilitischer 578 Nowack, K., Über die Grenzen der Verwertbarkeit des Malachit- grünagars 453 Ocker-Blom, M., Bestimmung der elektrischen Leitfähigkeit mit Bezug auf bakteriologische Zwecke 451 Oppenheim, 31., u. Sachs, O. , Eine einfache und schnelle Methode zur deutlichen Darstellung der Spirochaete pallida .... 579 Overton, J. B., Über Reduktionsteilung in den Pollenmutterzellen einiger Dikotylen 460 Pensa, A. , Osservazioni suUa distribuzione dei vasi sanguigni e dei nervi nel pancreas 438 Petersen, O., Über sekretorische Änderungen im Epithel der ab- leitenden Harn wege bei einigen Säugetieren 569 Phillii)S, D. P. A., Comparative Study of the Cytology and Move- ments of the Cyanophyceae 168 Pighinl, G., Sur l'origine et la formation des cellules nerveuses chez les embryons des Selaciens 441 Pinkiis, F., Über Hautsinnesorgane neben dem menschlichen Haar (Haarscheiben) und ihre vergleichend-anatomische Bedeutung . 160 Pötzsch, O., Über die Entwicklung von Niere, Perikard und Herz bei Planorbis corneus 161 Porcile, V., Untersuchungen über die Herkunft der Plasmazellen in der Leber 164 Porta, A. , Ricerche anatomiche suU'apparecchio velenifero di alcuni pesci 567 Preisich, K., u. Heim, P., Über die Abstammung der Blutplättchen 266 Prytz , K. , Mikroskopische Bestimmung der Lage einer spiegelnden Fläche. Optischer Kontakt 588 Quincke, G., Über Ausbreitung und Extensionskraft 301 — , — , Doppelbrechung der Gallerte beim Aufquellen und Schrumpfen 301 Ramön y Cajal, S., Neuroglia y neurofibrillas dei lumbricus . . . 444 Inhaltsverzeichnis. XI Seite Ramön y Cajal, S. , La methode h l'iii-gent reduit associee ä la methode embryonnaire poiir Tetiide des noyaux moteurs et sensitifs 273 — , — , siehe aiicli Cajal, S. Ramön y Cajal, S., y Garcia, D. D. , Las lesiones del reticulo de las celulas nerviosas en la rabia 443 Regaud, Cl., et Dubreuil, G., 8ur un nouveau procede d'argentation des epitheliums au moyen du protargol 418 Reitmann, K., Zur Färbung der Spirochaete pallida 577 Richards, Th. W,, a Wells, R, CL, The Nephelometer, an Instru- ment tbr Detecting and Estimating opalescent Precipitations 304 Rosenbusch, H. , Mikroskopische Physiographie der Mineralien und Gesteine 586 Rossi, E., L'intima struttura delle cellule nervöse umane 273 Riibaschkin, W., Studien über Neuroglia 158 Rufflni, A., Di una nuova guaina [guaina sussidiaria] nel tratto terminale delle fibre nervöse di senso nell'uomo 447 Rullmann , W. , Über das Verhalten des im Erdboden eingesäten Typhusbazillus 292 Rftzicka, V. , Über tinktorielle Differenzen zwischen lebendem und abgestorbenem Protoplasma 548 Sala, G., Beitrag zum Studium der feineren Struktur der Netzhaut . 291 Schalfer, K. , Neurofibrillenpräparate nach der Bielschowsky sehen Methode 564 Schmidt, .T. E., Beiträge zur normalen und pathologischen Histologie einiger Zellarten der Schleimhaut des menschlichen Darm- kanales 439 Schmorl, G., Die pathologisch-histologischen Untersuchungsmethoden 134 Scholz, F., Über Aceton-Celloidin-Schnelleinbettung 415 Schridde, H.,- Beiträge zur Lehre von den Zellkörnclungen. Die Körnelungen der Plasmazellen 550 Schröder, O. , Beiträge zur Kenntnis der Bauchsinnesorgane [Bauch- augen] von Eunice virides Gray sp. [Palolo] 424 SchüUer, M. , Über die Chromatinkörper der Krebs- und Sarkom- parasiten des Menschen 451 Schwarz, G. , Studien über im großen Netz des Kaninchens vor- kommende Zellformen 434 Seddig, M., Über „Wachstums"-Erscheinungen an Quecksilbertropfen 465 Seiter, Über Sporenbildung bei Milzbrand und andern sporenbilden- den Bakterien 573 Senft, E., Mikroskopische Untersuchung des Wassers mit bezug auf die in Abwässern und Schrautzwässern vorkommenden Mikro- organismen und Verunreinigungen 412 — , — , Über den mikrochemischen Zuckernachweis durch essigsaures Phenylhydrazin 298 Shattuck, Charles H., A morphological Study of Ulmus americana . 463 Shoemaker, D. N., On the Development of Hamamelis virginiana . 462 XII Inhaltsverzeichnis. Seite Skrobansky, Eine Methode der nachträglichen Färbung mit Bleu de Lyon und Pikrinsäure 138 Sniidt, E. F., Bacteria in relation to plant diseases. Vol. 1. Methods of werk and general literature of bacteriologj^ exclusive of plant diseases 580 Srdinko, O. V., Eine sichere Methode zur Differenzierung der Rinden- und Markelemente der Nebenniere, besonders bei Säugetieren und Menschen 437 Stark, M., Zusammenhang des Brechungsexponenten natürlicher Gläser mit ihrem Chemismus 307 Stead, J. E., Micro-Metallography with practical Demonstration . . 464 — , — , Methods for Detecting the mere Highly Phosphorised Portions in Iron and Steel 465 Stern, M., Histologische Beiträge zur Sekretion der Bürzeldrüse . . 569 Sternberg, K. , Eine Schnittfärbung nach der Romanowski sehen Methode 416 Stoeltzuer, W., Über Metallfärbungen verkalkter Gewebeteile . . . 545 Strasbiirger, E., Typische und allotypische Kernteilung. Ergebnisse und Erörterungen 460 Stroß , O. , Über das Wachstum der Gonokokken auf serumhaltigen Nährböden 294 Takayama, M,, Beiträge zur Toxikologie und gerichtlichen Medizin, nebst einem Vorwort von Prof. Dr. R. Kobert 557 Tellyesuiczky, K. v., Aufkleben der Celloidinschnitte 137 Thesing, C, Ein Wort zu dem Aufsatze von Dr. Giemsa „Bemer- kungen zur Färbung der Spirochaete pallida" 578 Thiroiix, Recher ches morphologiques et experimentales sur Trypano- soma paddae 140 Thomson, R. B., The Megaspore-membrane of the Gymnosperms . . 583 Thugiitt, St. J., Fritz Hindens „Neue Reaktionen zur Unterschei- dung von Calcit und Dolomit 303 Tiberti, N. , Über die Sekretionserscheinungen in den Nebennieren der Amphibien 164 — , — , Mikroskopische Untersuchungen über die Sekretion des Pankreas bei entmilzten Tieren 165 Triollet, M., Dispositif pour steriHser le catgut h l'autoclave . . . 454 Turban, Demonstration und Erläuterung mikroskopischer Präparate von Tuberkulose 574 Valediusky, I. A., Zur Frage über die Nervenknoten im Herzventrikel einiger Säugetiere. Vorläufige Mitteilung 44'2 Vanino, S., u. Hartl, F., Über neue Bildungsweisen kolloidaler Lö- sungen und das Verhalten derselben gegen Baryumeulfat . . 305 Varela de la Iglesia, R. , Contribuciön al estudio de la luedula espinal 445 Weidenreich, F., Studien über das Blut und die blutbildenden und -zerstörenden Organe. 2. Bau und morphologische Stellung der Blutlymphdrüsen 146 Inhaltsverzeichnis. XIII Seite Weinscheuk, E., Über die Skelettteile der Kalkschwämme .... 587 Winslow, Ch.-E. A., Elements of applied Microscopy. A text-book for beginners 135 AVoyeicki, Z., Einige neue Beiträge zur Entwicklungsgeschichte von Basidiobolus Ranarum 300 Wuttig, H. , Experimentelle Untersuchungen über Fettaufnahme und Fettablagerung 43(j York, Harlan H., The Agar-Agar and Paraffin Method for imbedding Plant Tissues 4G2 Zacharias, E., Über die Cyanophyceen 297 Ziegler, K., Histologische Untersuchungen über das Ödem der Haut und des Unterhautzellgewebes 145 Zietzschmaun , O., Über die acidophilen Leukocyten (Körnerzellen) des Pferdes 429 Zlatogoroff, S. J., Zur Mikrobiologie der Masern 450 — , — , Zur Morphologie und Biologie des Mikroben der Bubonenpest und des Pseudotuberkulosebacillus der Nagetiere [Bac. pseudo- tuberculosis rodentium] 452 Verzeichnis der Mitarbeiter an Band XXll. Dr. Gr. Arndt in München. Prof. Dr. H. Ambronn in Jena. E. Arbeit in Wetzlar. Dr. E. A. Bessey in Miami (Florida). C. F. Bödecker in Berlin. Dr. G. Cagnetto in Padua. Dr. Di Cristina in Berlin. Dr. P. Fiorentiui in Messina. Prof. Dr. Alfr. Fischer in Basel. H. Freund in Halle a. S. Prof. Dr. F. C. C. Hansen in Kopenhagen. Prof. Dr. M. Heidenhain in Tübingen. Dr. 0. Henker in Jena. Prof. Henneberg in Gießen. Dr. W. Hoftmann in Berlin. Dr. J. Just in Prag. P. Kouaschko in Kiew. Dr. E. Küster in Halle a. S, Dr. 0. Levy in Halle a. S. Dr. K. Melissinos in Athen. Verzeichnis der Mitarbeiter an Band XXII. XV Dr. C. Metz in Wetzlar. Dr. L. Neumayer in München. A. Paiily in Wien. Prof. W. Pavlow in Charkow. Prof. Dr. K. Peter in Greifswald. Dr. 0. Richter in Prag. Dr. VI. Rüzicka in Prag. Prof. Dr. P. Schiefferdecker in Bonn. Prof. Dr. H. Schmaus t in München. Dr. J. Schneider in Prag. Dr. E. Schoebel in Neapel. Dr. S. L. Schonten in Utrecht. Dr. G. Seliber in Paris -Charlottenburg. Dr. A. Siding in Wien. M. Signer in Messina. Dr. E. Sommerfeldt in Tübingen. Prof. Dr. K. Strehl in Erlangen. Prof. Dr. H. Triepel in Greifswald -Breslau. W. Wangerin in Halle a. S. Band XXIL Heft 1. Beugungsbild und Absorptionsbild. Von Karl Strehl in Erlangen. In meiner Abhandlung: „Theorie der allgemeinen mikrosko- pischen Abbildung" (Erlangen, 1900), welche scheinbar fast un- bemerkt geblieben ist, habe ich gezeigt, daß es nur eine Theorie der optischen Instrumente gibt, die Beugungstheorie, und daß die sogenannten Theorien von Abbe und Rayleigh nur formal, nicht sachlich verschiedene Betrachtungsweisen vorstellen, so wie man z. B. auf dem Gebiete der Geometrie eine analytische und eine synthe- tische Methode der Behandlung kennt. Die Wirkungsweise des Mikroskops ist so "wenig anders wie die des Fernrohrs, daß wenn z. B. ein Planet - — etwa Mars — gitterförmiges Detail nach Art einer Diatomee zeigen würde, dann annähernd die Abbe sehe „Theorie" anwendbar wäre.-^ Der Unterschied ist nur der, daß die Art der Beleuchtung des Planeten durch die Sonne eine Resultante aller möglichen Phasen erzeugt, während bei der Diatomee die Beleuchtungs- weise mit streng gleicher Phase möglich ist. Es .handelt sich mithin nicht um dies, welche Anschauungsweise die richtige sei, nur um das, welche in jedem einzelnen Fall leichter zum Resultat führt. Um so merkwürdiger mußte es mich berühren, als ich in „Dr. A. Winkelmann: Handbuch der Physik 2. Aufl. VI. Bd. 1. Hälfte, Optik I" p. 380 das Werk: „Stefan Apathy: Die Mikrotechuik der tierischen Morphologie 2. Abt." (Leipzig, 1901) zitiert fand, von welchem es heißt, daß es „die Abbe sehe Theorie 1) Vgl. Zentralz. f. Optik u. Mach. Bd. XXVI, 1905, No. 6. Zeitschr. f. wiss. Mikroskopie. XXII, 1. 1 2 Strehl: Beugimgsbild und Absorptionsbild. XXII, 1. der mikroskopischen Bilderzeugimg bestreitet". Es schien lohnens- wert, das Werk kommen zu lassen, und ich bin für die Mühe der Durchsicht einigermaßen auf meine Kosten gekommen mit dem Erfolg, daß ich im nachstehenden eine kritische Würdigung der Anschauungen Apathy's bieten will, in dem Sinne, daß ich nicht sowohl bei den zahllosen Eiuzelsätzen und fortgesetzten Wiederholungen des Ver- fassers jeden einzelnen Satz bestätigen oder bestreiten werde — dies würde Bände geben — wie vielmehr die meiner Ansicht nach wichtigsten Punkte herausgreifend gleich meine Meinung kundgeben möchte, wobei in Klammer hinten die Seitenzahl bei Apathy bezw. Abbe beigefügt wird. Zunächst kann ich feststellen: ApAthy leugnet nicht die Abbe sehe Theorie, er schränkt sie nur ein (517). Er ist nämlich der Ansicht, daß das gewöhnliche mikroskopische Bild gleichsam eine Übereinauder- lagerung von drei der Art nach gänzlich verschiedenen Bildern sei, einem Beuguugsbild im Sinne Abbes, einem Refraktionsbild und einem Absorptionsbild, welch' letzterem ApÄthy den Vorzug gibt. I. Beiiguiigstheorie und geometrische Optik. Eine Erörterung der theoretischen Verhältnisse erscheint schon um so mehr augebracht, als bis auf diesen Tag Mängel der Theorie, Mißverständnisse und Vermischung von Beugungstheorie und geo- metrischer Optik sich die Hand reichen. So hat z. B. der Begriff: „schmaler Lichtkegel" Verwirrung erzeugt. In dem Werk: „Gesammelte Abhandlungen von Ernst Abbe" dürfte der Satz (291): „. . . nun war aber ohne jede weitere Rechnung sogleich einleuchtend, daß der immer anwachsende Beugungseffekt bei fortschreitender Verringerung des einfallenden Lichtkegels . . . jedenfalls bei solchen schmalen Beleuchtungskegeln das der vollen Öffnung zugängliche Detail längst ausgelöscht haben mußte" Mißver- ständnissen ausgesetzt gewesen sein. Hier muß ich gleich bemerken, daß es eine Wirkung dieses „schmalen Lichtkegels" überhaupt nicht geben kann, mithin auch keine Beugungswirkung (513), weil er nur ein Phantom der geometrischen Optik ist, vergleichbar einem aus je einem Soldaten aller Nationen der Erde zusammengewürfelten Bataillon. Beugungstheoretisch dürfen stets nur solche Strahlen zusammengefaßt werden, welche kohärent d. h. interferenzfähig sind XXII, 1. Strehl: Beugungsbild und Absorptionsbild. 3 und erzeugen auch bei selbstleuchtenden Objekten nur kohärente von einem Inchtpunkt ausgehende Strahlen den Bildpunkt (519). Es ist z. B. falsch, daß bei sphärischer Aberration je nach Ein- stellung verschiedene Ordnungen von Beugungsspektren zur Wirkung kommen (566). Stets kommen alle Beugungsspektra, jedoch in ver- schiedener sich störender oder gar zerstörender Weise zur Wirkung. Mit Recht rügt Apathy, daß Abbe die Sehtiefe ohne Rücksicht auf die Theorie der sekundären Abbildung d. h. eben die Beugungs- theorie behandelt (530). In meiner eingangs erwähnten Schrift ist dem Maugel abgeholfen. Am merkwürdigsten dürfte sein, daß man zwar seit Abbe eine Erklärung der Wirkung von Mikroskopobjektiveu auf beugungs- theoretischer Grundlage — freilich nur ganz allgemein — hatte, die Konstruktion und Untersuchung derselben aber meines Wissens bis vor kurzem nach den Anschauungen der geometrischen Optik geschah. Hier sucht meine Studie: „Untersuchung eines Mikroskopobjektives" (Zeitschr. f. Instrumentenkunde Bd. XXV^, 1905, p. 3) Wandel zu schaffen. II. Beugungsbild. 1. Existenz der „Öffnungsbeugung". Abbe scheint mit dem Satz (293): „. • . daß bei der Abbildung. . . mittels durchfallender oder reflektierter Strahlen eine Öftnungs- beugung . . . überhaupt nicht eintreten kann, daß eine solche viel- mehr prinzipiell auf den Fall selbstleuchtender Objekte beschränkt ist" die vom Fernrohrobjektiv her bekannte ÖÖnungsbeugung d. h. nicht etwa mißverstandenerweise die Beugung der Strahlen am materiellen Rand der Fassung, sondern den für die Größe des Bildpunktes wichtigen Umstand, daß die Glasscheiben nicht un- begrenzt groß sind, ausdrücklich geleugnet zu haben (504). Rayleigh gründet seine „Theorie" auf diese Öffnungsbeugung. Tatsächlich existiert diese auch beim Mikroskop; denn was ist der Umstand, daß der die num. Ap. bestimmende Rand der Fassung in der hinteren Brennebene des Objektives die Beugungsspektra höherer Ordnung abschneidet, mithin nur der mehr oder minder große mittlere Teil der ganzen Beugungsfigur zur Wirkung kommt, anders als eben Öffnungsbeugung? Man darf nur nicht vergessen, daß es neben den 1* 4 • Strehl: Beugungsbild und Absorptionsbild. XXII, 1. Maxima 1. Ordnung — nicht zu verwechseln mit den Ordnungen der Beugiingsspektra; dies sind lauter Max. 1. Ordnung — schon im einfachsten Fall auch solche 2. Ordnung gibt, ja strenggenommen die Beugungsfigur stets kontinuierlich ist (512). Je mehr von dieser abgeschnitten wird, desto schlechter wird die Abbildung. Es tut gar nichts zur Sache, ob ich statt der hinteren Brennebene des Objektives die Austrittspupille des ganzen Mikroskops über dem Okular zu Rate ziehe. Ich bitte nur zu beachten, ' daß dort die- selben Beugungsspektra nur in kleinem Maßstab sich wieder finden (506). Wenn man die Austrittspupille verkleinert, dann werden Beugungs- spektra abgeschnitten (507). 2. Beseitigung der „OflFnungsbeugung". Apäthy bemüht sich mit der Frage der Beseitigung der Öff- nungsbeugung. Diese kann natürlich nicht beseitigt werden (521, bezw. 490), denn sie hängt mit der Art der Bilderzeugung zu- sammen : Objektive von unendlicher linearer Öffnung bei endlicher Tubuslänge, bezw. unendlich kleine Wellenlängen gibt es eben nicht. Apathy hält es für nützlich die Lichtquelle in die Objektivöffnung zu projizieren (520). Allein auch in diesem Falle kann das Bild nicht als ein Schattenbild nach geometrisch -optischen Gesetzen auf- gefaßt werden, vielmehr wird jede Stelle des Präparates zu einem sekundären Lichtpunkt; wo die Beleuchtungsstrahlen an und für sich ihren Schnittpunkt haben , ändert an der Sache gar nichts. Der ganze Unterschied wäre der : Bei Projektion der Lichtquelle in die Objektivöffnung wird ein großer Teil des Präparats mit kohärentem Licht von kontinuierlich sich ändernder Phase beleuchtet. Bei Pro- jektion einer selbstleuchtenden Lichtquelle in die Präparatebene leuchtet das Präparat Stelle für Stelle mit gegenseitig inkohärentem Licht. Ob wirklich erstere Beleuchtungsart — vielleicht infolge von der über das Präparat wandernden Phasenverschiebung — einen nennenswerten Vorteil ergibt , möchte ich dahingestellt sein lassen : Die Öffnungsbeugung wird weder so noch anders beseitigt. XXII, 1. Strehl: Beugungsbild und Absorptiunsbild. 5 III. Refraktionsbild. 1. Schiefe Beleuchtung. Hier möchte ich zeigen , daß wenn schiefe Beleuchtung- bei dickem Präparat ganz seltsame Dinge zeigt , man dann nicht erst auf das Refraktionsbild zurückkommen muß, dies vielmehr beugungs- theoretisch so sein muß. a) Streifen lose Schichten. Setzen wir voraus, das Präparat bestehe aus strukturlosen durch- scheinenden Schichten parallel zur Tischebene mit den Abständen X. Wenn wir gerade Beleuchtung mit enger Blende verwenden , dann erblicken wir ohne Okular nur ein weißes ungebeugtes Hauptmaximum ohne jedes Beugungsspektrum — vorausgesetzt ist natürlich ein Objektiv von der num. Ap. = 1, mit Okular ein gleichförmiges Ge- sichtsfeld. Wenn wir hingegen äußerst schiefe, d. h. wagrechte Beleuchtung verwenden , dann wirkt das Präparat als Gitter und sendet neben dem jetzt am Rand zu liegen kommenden weißen un- gebeugten Hauptmaximum mindestens noch ein hier in die Achse fallendes Beugungsspektrum in das Objektiv : wir erblicken eine zur Verbindungsstrecke senkrechte Streifung. b) S ch i cht en 1 se Streifen. Setzen wir als Präparat strukturlose Streifen (im Sinne von Papier- „streifen") senkrecht zur Tischebene mit den Abständen X voraus. Bei gerader Beleuchtung erblicken wir unter Verwendung eines Ob- jektivs von der num. Ap. = 1 natürlich ohne Okular ein weißes ungebeugtes Hauptmaximum in der Achse und beiderseits am Rand je ein Beugungsspektrum , mit Okular ein Bild der Streifung. Bei äußerst schiefer (wagrechter) Beleuchtung kann das Präparat nicht als Beugungsgitter wirken, wir erblicken ohne Okular nur ein weißes ungebeugtes Hauptmaximum am Rand, mit Okular ein gleichförmiges Gesichtsfeld. Daß man in Wirklichkeit auch in diesem Fall die Strei- fuug sieht , kommt davon her , daß die notwendigen Bedingungen sich schwer rein verwirklichen lassen; daß man für gewöhnlich bei sehr schiefer Beleuchtung Streuungen äußerst scharf sieht, hängt mit andern Verhältnissen zusaiiimen, d. h. man sollte sie eigentlich 6 Strehl: Beugungsbild und Absorptionsbild. XXII, 1. bei gerader Beleuclituug ebenso scharf sehen, wären nicht hindernde Umstände vorhanden. Wir sehen, schiefe Beleuchtung neigt dazu, an Stelle der Struktur parallel zur Tischebene beim dicken Präparat die Struktur senkrecht zur Tischebene zu zeigen. Wenn es auch nicht dazu kommt, daß erstere ausgelöscht wird, dann wird es doch vorkommen, daß letztere sich störend einmischt, und dies selbst bei gerader Beleuchtung am Rand dicker Präparate aus dem umgekehrten Grunde. Ich bin des- halb mit Abbe entschieden der Ansicht, daß dünne Präparate und gerade Beleuchtung die wissenschaftliche Normalbeobachtungsform ist. 2. Refraktionsbild. Gleichwohl will ich Apathy nicht unrecht geben ; es gibt zweifels- ohne Wirkungen der Absorption (Schatten) , Brechung , totalen und partiellen Reflexion (Richtungsänderung) , Verzögerung (Phasenände- rung) im Präparat (574). Nur darf man sich ja nicht vorstellen, daß diese Prozesse im Gebiete der Größenordnung der Wellenlänge auch durchaus so verlaufen müssen, wie an Objekten von endlicher Größe. Die Experimente von Braun (Nachahmung der elektrischen Ver- suche von Hertz mit Lichtwellen an mikroskopischen Gittern) haben vielmehr ergeben , daß je nach der Größe der Gitterkonstante die Polarisation bald senkrecht, bald parallel zu den Gitterstäben ver- läuft. Theoretische Untersuchungen über die Polarisation des Lichtes bei Spiegelung an Kugeln von der Größe X ergaben verschiedene Resultate bezüglich des günstigsten Polarisationswinkels für Kugeln aus Metall und Kugeln aus dielektrischen Stoff'en. Praktische Unter- suchungen ergaben eine verschiedene Reflexions- bezw. Zerstreuungs- fähigkeit an Kugeln von der Größe einer Wellenlänge und Kugeln, welche klein gegen l sind (Rayleigh). Durch Moleküle geht das Licht möglicherweise ohne Richtungsänderung, nur geschwächt und freilich mit Phasenänderung, hindurch. Ich bin der Ansicht: Wie sich elektrische Wellen gegen Objekte von gewöhnlicher Größe verhalten , so verhalten sich Lichtwellen gegen mikroskopische Objekte. Die Durchleuchtung mikroskopischer Präparate ist ein Abbild im kleinen der Telegraphie ohne Draht durch Hindernisse. Aus letzterer wird man vielleicht noch bezw. erst viel über erstere erfahren. XXII, 1. Strehl: Beugungsbild und Absorptionsbild. IV. Al)Sorptionsbil(l. Nach Apathy sind die beiden Bedingungen des reinen Absorp- tionsbildes : 1) Die Lichtbrechimgeu im Objekt müssen ausgeglichen werden. 2) Beleuchtung mit voller Apertur (572). 1. Färbungsbild. Daß sich die Zwischen- und Querscheiben beim quergestreiften Muskel färben lassen, halte auch ich für sehr wichtig (582). Nur muß man berücksichtigen, daß verschiedene Färbbarkeit bezw. sogar Färbung nicht immer Anzeiclien stofflicher Verschiedenheit, manchmal nur von verschiedener Diclitigkeit sein wird. Abbes Unterscheidung zwischen Absorptionsbild und Struktur- bild, die er später glücklich fallen ließ, denn beides sind Beugungs- bilder, hat gar nichts zu tun mit Apathys Färbungsbild (508). 2. Selbstleuchtendes Bild. Wenn man mit einem Kondensor von größerer Apertur als das Objektiv das Bild einer selbstleuchtenden Lichtquelle in die Präparat- ebene wirft, dann leuchtet jede noch auflösbare Stelle mit eigenem (inkohärentem) Licht. Auch dies ist gleichsam ein Färbungsbild, nur für gewöhnlich arm an Farben : hell und dunkel. Auf diese Weise betrachtet man ja die Bakterien. Indem Apa'thy nach Mög- lichkeit färbt, macht er sich von der Bedingung des Selbstleuchtens frei ; denn z. B. ein rotes Korn und ein blaues Korn nebeneinander leuchten auch mit gegenseitig interferenzunfähigem Licht. Durch die Aufhellung des Präparates (Beseitigung von allen Lichtbrechungen) sucht Apathy Störungen fernzuhalten, durch Be- leuchtung mit voller Apertur das leider durch die Aberrationen der Objektive getrübte Maximum des Auflösungsvermögens zu erzielen. Dieser Weg ist rationell. V. Vergleichuug (Mischbild). Für gewöhnlich hat man nun nach Apathy eine Mischung von Beugung (im engeren Sinne) , Refraktion (im weitesten Sinne) und 8 Strehl: Beugungsbild und Absorptionsbild. XXII, 1. Absorption. Diesen gestörten Durchgang des Lichtes durch ein Präparat nannte ich in meiner Abhandlung „Beugung" schlechthin. Je nachdem man Planspiegel, Hohlspiegel, direkte oder indirekte Lichtquelle, Kondensor mit großer oder kleiner Öffnung und scharfer oder unscharfer Einstellung verwendet, wird die Wirkung verschieden (554) , indem bald mehr , bald weniger benachbarte Elemente mit kohärentem Lichte von größerer oder kleinerer PhasendifFerenz be- leuchtet werden. Rechnerisch ist nichts unmöglich, nur müßte man stets die Bedingungen genau kennen und ist die Rechnung nicht immer kurz. Helmiioltz , Abbe , Rayleigh behandelten in ihrer „Theorie" ja nur die allereinfachsten Sonderfälle. Ich bin syste- matisch weiter gegangen, soweit dies einen Sinn hat. Bei den kom- plizierten Beobachtungsfällen heißt es eben : „Probieren geht über Studieren." 1. Auflösungsvermögen. Isolierte helle Objekte sind bei genügend intensiver Beleuchtung bis fast zur Eiweißmolekülgröße herab sichtbar. Isolierte dunkle Objekte erfordern eine gewisse Größe, um sicht- bar zu sein (vgl. meine demnächst in der Instrumentenkunde er- scheinende „Astrophotometrie"). Etwas anders ist die Trennung mehrerer Objekte, und wieder verschieden die von 2 oder oc vielen, beleuchteten oder selbstleuchten- den, Punkten oder Geraden oder Flächen, hellen auf dunklem oder dunklen auf hellem Grund. All diese Fälle habe ich längst berechnet. Mikroskop oder Fernrohr macht hier keinen Unterschied. Sehr ver- schieden sind die Werte im allgemeinen nicht (582). ApATHYS Absorptionsbild ergibt dem allgemeinen Auflösungs- vermögen nach keine Verbesserung. Wenn ein rotes und ein grünes Korn in nicht mehr auflösbarem Abstand nebeneinander liegen, dann verschmelzen eben das runde rote und das runde grüne zu einem links rot, in der Mitte weiß, rechts grün gefärbtem ovalen Beugungs- scheibchen (553). Gewonnen wird hierdurch im wesentlichen nichts. 2. Objektähnlichkeit. Die Erklärung der verschiedenen Pleurosigmabilder blieb nicht etwa bei einem vergeblichen Versuch stehen (567) ; ich empfehle XXII, 1. S t r e h 1 : Beugungsbild und Absorptionsbild. 9 diesbezüglich das Studium meiner Abhandlung : „Das Pleurosigma- bild" fZeitschr. f. Instrumentenkunde XIX, p. 325, 1899). Daß das Beugnngsbild zu zahllosen Täuschungen Anlaß gibt, ist nicht neu und längst erörtert, besonders der Begritf „Tiefenbild". Es fand denn auch Apathy bei Triceratium und verschiedener Ein- stellung nicht weniger als 15 Bilder, welche von der Lage der Schale niclit abhängen , und 2 , welche bei Ümwendung derselben umgekehrte Einstellung erfordern (514). Ich halte es für glaubhaft, daß Apathys Färbungsbild nach der Seite der Objektähnlichkeit einen Fortschritt darstellt, und daß er auf diese Weise neue und wichtige Resultate fand, ohne die letz- teren selbst beurteilen zu können. Wenn Abbe sagt (291), „denn beim wirklichen Gebrauch stär- kerer Objektive hatte ich, außer für ganz exzeptionelle Zwecke, nie- mals eine andere (Beleuchtung) in Anwendung, oder auch nur mit Vorteil anwendbar gefunden", dann möchte ich bemerken, daß Abbe in erster Linie Physiker war, auch daß sich sein „schmaler Licht- kegel" auf die Unterscheidung an dünnen Präparaten bezog (510). Tl. Beleuchtungsstärke. „Planspiegel" ist nichts anderes als „Lochblende" bei direkt gegen eine Lichtquelle gehaltenem Tubus. „Hohlspiegel" ist nichts anderes als „Planspiegel -|- Linse". Der allgemeinste Fall ist theoretisch eine Linse vom Öffnuugs- halbmesser r und der Brennweite /", im Abstand d vom Präparat, das Mikroskop direkt auf eine (runde) Lichtquelle von der halben Winkelöffnung 99 und dem spezitischen Leuchtvermögen e gerichtet. Die in 1 sec durch 1 qmm der Linsenöffnung gehende Licht- menge ist proportional e sin' cp ; wäre keine Linse da , wäre dies die Wirkung des Planspiegels auf die Präparatebene (vorausgesetzt, daß vom Präparat aus die ganze Lichtquelle durch den Planspiegel übersehbar ist; außerdem hätte man 99 eben zu reduzieren). Die durch die Linse eintretende Lichtmenge e sin- 99 • >■- n (wo- bei alles in mm zu messen) wird konzentriert auf die Kreisfläche s-71 in der Präparatebene. Die Wirkung des Kondensors auf die Prä- paratebene ist mithin e sin" 99 • V'^js^'^ um s zu berechnen, setze man zunächst o = f- tan 99 = Radius des Bildes der Lichtquelle und hat 10 Schouten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. schließlich s = r — (r — 0) • djf-^ bei scharfer Einstellung des Kon- densors ist die Wirkung auf die Präparatebene s sin'-^ 99 • r-/a-. Schließlich möchte ich noch erwähnen, daß der Kondensor den Wolkenhimmel oder staubige Fenster mehr oder minder scharf in der Präparatebene abbildet und aus diesem rein praktischen Grund oft Anlaß zu schlechten Bildern gibt. [Eingegangen am 24. Februar 1905.] [Aus dem botanischen und dem hygienischen Institut der Universität in Utrecht.] Reinkulturen aus einer unter dem Mikroskop isolierten Zelle. Von Dr. S. L. Schouten in Utrecht. Hierzu dreizehn Holzschnitte. Einleitung. Kochs Plattenkulturmethode ist es zu danken, daß das Studium der Mikroorganismen und speziell die Bakteriologie in der letzten Zeit so außerordentliche Fortschritte gemacht haben. Aber dennoch ist die Herstellung einer Reinkultur vieler Mikroorganismen noch ein ungelöstes Rätsel. Viele Forscher v^^erden meinen, dieses sei nicht die Folge eines Mangels, welchen diese Methode als solche hat, sondern es hänge vielmehr damit zusammen , daß die richtige Zusammensetzung des Nährbodens in solchen Fällen noch unbekannt ist. Sie denken, daß die Herstellung einer Reinkultur vermittels der Plattenkulturmethode sicherlich gelingen wird, wenn diese erst gefimden ist. Obgleich es mir selbstverständlich fern liegt, Kochs geniale Erfindung auch nur im geringsten zu bekritteln , ich vielmehr ihren XXII, 1. Schonten: Reinkultureneiner unter d. Mikroskop isoliert. Zelle, n Wert voll anerkenne , glaube ich doch , daß obige Meinung falsch ist , und daß im Verfahren selbst die Ursache dafür liegen kann, daß es bisher bei vielen Mikroorganismen resultatlos verwendet, wurde. Das ist z. B. der Fall bei verschiedenen größeren Organismen, welche in Medien vorkommen, worin sich zugleich viel Bakterien befinden, wie Amöben, Infusorien, große Sporen von Pilzen, von Myxomyceten etc. Ich glaube, daß die Reinkultur solcher Organismen oft deshalb mißglückt ist , weil es außerordentlich schwierig ist , sie durch Schütteln (der Hauptfaktor der Plattenkulturmethode) von den Bakterien zu befreien , die in ihrer unmittelbaren Nähe liegen oder auf ihrer Außenseite festsitzen ; die Folge ist , daß wolil Kolonien entstehen, aber daß nach kürzerer oder längerer Zeit sich doch die Verunreinigungen durch Bakterien zeigen. Auch ist es möglich, daß die chemischen Eigenschaften der Gelatine als solche schädlich auf die Entwicklung wirken. Das ist z. B. durch Winogradsky bewiesen für die Nitrit- und Nitrat-bildenden Bakterien in der Erde. Diese können auf Nährböden, welche reich an organischen Nährstoffen sind , nicht gedeihen. Es ist durchaus nicht gewagt , a priori anzunehmen , daß dies mit mehreren Arten von Bakterien der Fall ist , welche man bisher noch nicht in Rein- zucht hat gewinnen können. Endlich kann vielleicht die physische Natur der Gelatine, nämlich die Tatsache , daß sie einen festen Nährboden liefert , der Grund sein für die negativen Resultate , die man bisher bei einigen Organismen erzielt hat. Wenn diese nämlich in der Natur nur in flüssigen Medien vorkommen und auch ihr Bau (z. B. der Besitz von Cilien) und ihre Lebensverrichtungen fz. B. schnelle Bewegung) ver- raten, daß sie speziell für flüssige Medien geeignet sind, dann wird man sich a priori nicht wundern, daß man unter ihnen einige findet, die auf einem festen Nährboden weniger gut oder überhaupt nicht wachsen können. Das kann z. B. zugleich mit den oben angegebenen Gründen eine der Ursachen sein , daß Amöben und Myxomyceten, die in ihrer Entwicklung ein Schwärmerstadium durchlaufen , sowie Infusorien und viele Bakterien, die sehr beweglich sind, noch nicht rein gezüchtet werden konnten. Doch, was auch die Gründe sein mögen , es ist eine Tatsache, daß man von vielen Organismen auf keinerlei Weise , auch nicht vermittels der Plattenkulturmethode , eine Reinkultur hat herstellen können. 12 Scheuten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. Diese und andere Gründe ließen es mir als nicht überflüssig erscheinen, auf dem Gebiete der Eeinknlturtechnik einmal einen ganz neuen Weg zu versuchen und zu sehen, zu welchen Resultaten ich damit kommen würde. Die Resultate sind in kurzen Worten folgende. Man kann mit Hilfe von feinen Glasnadeln , deren Bewegung vermittels einer be- stimmten Mechanik vollständig geregelt wird , aus einem Gemenge verschiedener Mikroorganismen einen beliebigen isolieren und auf einen Nährboden überführen. Zu diesem Zweck bringt man von dem Material, aus dem man eine Zelle isolieren will, einen Tropfen auf ein Deckglas und daneben in einigem Abstand einen Tropfen von dem Nährboden, in welchem die Kultur entstehen soll. Das Deckglas wird auf eine feuchte Kammer gelegt, die sich auf dem Objekttisch des Mikroskops befindet, und durch deren Seitenwände man die genannten Nadeln so gestochen hat , daß sie mit ihren Spitzen das Deckglas berühren können. Vermittels der Nadeln kann man nun mit der stärksten Vergrößerung eine Bakterie oder eine andere Zelle aus dem Tropfen isolieren und in einen andern über- führen. Danach wird das Deckglas auf eine einfache feuchte Kammer gelegt, die, wenn nötig, in einen Brutschrank gesetzt werden kann. Das Wachstum der Kolonie kann von Anfang an dann auch mit der stärksten Vergrößerung beobachtet werden. Nicht nur für den oben beschriebenen Zweck , die Gewinnung von Reinkulturen im allgemeinen, sondern auch für viele andere Probleme , welche man nicht im voraus zu bestimmen imstande ist, kann die neue Methode nützlich sein. Es muß doch im allgemeinen von großem Interesse sein, daß mau jetzt eine Bakterie oder etwaige andere Mikroorganismen ebensogut „aussäen" kann als eine höhere Pflanze, daß man ilire Entwicklung von Anfang an beobachten, daß man sie, mit einem Wort, individuell behandeln kann. Auf ein Problem, für welches ich die Methode besonders ge- eignet halte, und worüber ich weiter unten einige Versuche mit- teilen werde , will ich schon jetzt weisen. Ich meine das der Variabilität und der Pleomorphie. Jedermann muß zugeben, daß auf diesem Gebiete noch viel methodisch gearbeitet werden muß. Wer nur ein wenig tiefer in die Bakteriologie und speziell in die bakteriologische Systematik eindringt, wird zu dem traurigen Schluß kommen, daß durch die unmethodischen Arbeiten vieler Forscher der letzten .lahre das Material wie in einem Augiasställe aufgehäuft ist. Es wäre wünschenswert, daß man endlich einmal ein Ende XXII, 1. Schouten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. 13 machte mit dem oft ganz unmotivierten Beschreiben „neuer" Arten. Viele Forscher , welche jetzt irgendwo eine Bakterie finden , stellen eine Kulturplatte dar, beobachten das Wachstum auf einigen der gebräuchlichsten Nährböden und warten ab, ob sie eine Ähnlichkeit mit einer schon bestehenden Art konstatieren können. Finden sie diese nicht gleich bei ihren ersten Versuchen, dann glauben sie der Wissenschaft wunders einen Dienst zu erweisen, wenn sie die „neue" Art, begleitet von einer Diagnose, die in gar vieler Beziehung dunkel ist oder größtenteils sich in allgemeinen Ausdrücken bewegt, in die Welt schicken. Darum aber bekümmern sie sich nicht , welchen ändernden Einfluß etwa frühere Lebensumstände auf die gefundene Bakterie gehabt haben können, oder welche Modifikationen die von ihnen verwendeten Nährböden imstande sind noch zu verursachen. Und das sind doch, neben vielen andern, immerhin sehr belangreiche Faktoren. Daher kommt es, daß man viele Arten, die man anfäng- lich als verschieden ansah, später doch als gleich beurteilen lernte, daß man es mit andern Worten mit pleomorphen Formen zu tun gehabt hatte , und daß man anderseits Arten , die man früher für gleich angesehen hatte, scheiden mußte. Wie dem auch sei, es herrscht eine entsetzliche Verwirrung auf dem Gebiete der bakteriologischen Systematik, einmal infolge der großen Schwierigkeiten, die das zu bearbeitende Material selbst für den kundigsten Forscher hat, dann infolge des unachtsamen und flüchtigen Arbeitens anderer. Will man dieser Verwirrung so viel als möglich Einhalt tun, dann muß vor allem die Variabilität und der Pleomorphismus gründlich studiert werden. Und für ein solches Studium ist es notwendig, darüber durchaus sicher zu sein, daß man bei der Herstellung der Reinkultur auch wirklich von nur einer Zelle ausgegangen ist. Ferner muß man unbedingt jede folgende Generation für sich imtersuchen können, wenn man einen Mikroorganismus sich unter veränderten äußeren Umständen teilen läßt, ebensogut wie man bei höheren Pflanzen alle aufeinander folgenden Generationen auf diesen Punkt untersuchen kann. Wenn man z. B. dem nachgehen will, was für einen verändernden Einfluß eine sauere Nährflüssigkeit auf einen bestimmten einzelligen Organismus a hat, dann muß man a sich in der saueren Flüssigkeit in zwei Zellen a^ -\- a^ teilen lassen können, die eine Zelle a^ sofort auf einen gewöhnlichen Nährboden bringen, die andere sich wiederum in a.^ -(- «3 teilen lassen können. Danach muß man wieder die eine Zelle «„ ^nf denselben gewöhnlichen Nähr- 14 Schonten: Reinkultureneinerunterd. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII. 1. bodeu bringen, und die andere sich wiederum zu a.^-\-a^ teilen lassen, etc. Auf solche Weise erhält man Kulturen der aufeinander folgenden Generationen a^^ a.^j a.^ etc., und kann studieren, inwie- weit die veränderten P^ormen allmälilich ineinander übergehen oder auch sprungweise durch Mutation auseinander ent- standen sind. Ich bilde mir durchaus niclit ein, daß diese meine Methode ein Mittel ist, mit der man alle möglichen Reinkulturen herstellen kann (denn welche Methode ist überhaupt unbegrenzt brauchbar!), oder daß sie gar die schon bestehende Reinkulturmethode, die in so vieler Beziehung ausgezeichnete Plattenkulturmethode verdrängen wird. Ich kann mir sehr gut Fälle vorstellen, in denen sie nicht bequem, vielleicht gar nicht anwendbar ist, z. B. wenn die Bakterien sich zwischen sehr feinen, aus Stäbchen und kleineu Partikelchen be- stehenden Detritus befinden. Mein Ziel ist nur, sie anzuwenden, solange man auf keinem andern einfacheren Wege zum Ziele kommt. Zum Schlüsse noch die kurze Bemerkung: die Gruudleger der Mykologie (de Bary, Brefeld n. a.) sind bei der Herstellung ihrer Pilzkultureu immer nur von einer Zelle in einem hängenden Tropfen ausgegangen. Bekanntlich war ihre Methode, eine Masse Sporen und Conidieu in einer sterilisierten Flüssigkeit zu verteilen, auf ver- schiedeneu Deckgläsern dann eine Menge hängender Tropfen anzu- bringen und solange zu suchen, bis sie einen Tropfen fanden, in dem sich eine Spore oder Conidie befand. Die Kulturflüssigkeiten wurden ein wenig sauer genommen, um Bakterienentwicklung zu verhindern. Für morphologische Studien sind solche Kulturen sehr geeignet, aber als Ausgangspunkt für physiologische Untersuchungen nicht, denn für die Reinheit kann man durchaus nicht garantieren. Ihre Methode ist aber nicht brauchbar für kleinere Zellen, und durch- aus nicht für Bakterien. Beschreibung des Isolierapparates. Figur 1 gibt eine schematische Darstellung des Instrumentes, das zur Isolierung dient. Die Zeichnung stellt einen 1 : 4 ver- kleinerten vertikalen Durchschnitt durch die Mitte des Apparates dar. Ä ist eine eiserne Platte, die aitf vier Füßchen steht. Das Mikroskop ist vermittels eines Bügels auf einer viereckigen kupfernen Platte B befestigt. Durch Drehung einer Schraube kann man das XXll, 1. Schonten: Reinkultureneiner unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. 15 Mikroskop mit B nach links und rechts bewegen, vermittels einer anderen Schraube vorwärts und rückwärts. Von dem Mikroskop ist gezeichnet der Objekttisch jF, der Be- leuchtungsapparat von Abbe G^ die Irisblende H^ der Spiegel /, der Fuß J und ein Objektiv K. Auf dem Objekttisch befindet sich eine feuchte Kammer, die „Isolierkammer" Z, die eine besondere Konstruktion liat. Ihre linke und rechte Seitenwand nämlich sind mit einem horizontalen Spalt versehen, der mit dickem Öl ver- schlossen werden kann. Durch diese sind zwei Glasnadeln M ge- stochen, deren Form unten beschrieben werden soll. Zwei Glasstücke, die sich oben an den Spalten befinden, können M^eggenommen wer- den, wenn man die Nadeln herausnehmen oder wieder an ihren Platz bringen will. Wenn man sie zu diesem Zwecke jedesmal wieder durch den Spalt stecken müßte, so würde man Gefahr laufen, die feinen Spitzen, auf die alles ankommt, abzubrechen. Auf die feuchte Kammer , die vermittels eines beweglichen Objekttisches (ich gebrauche den von Leitz, No. 99 aus Katalog Xo. 39) verschoben werden kann, bringt man das Deckglas, an dessen Unterseite die Isolierung vorgenommen werden soll. Die Nadeln sind jede in einem Halter N befestigt, der sich auf einem Kupferstab befindet, der um einen Punkt P drehbar ist. Am Ende des Stabes befindet sich ein rundes Stahlplättchen, ver- mittels dessen er auf einem vertikalen Stab R ruht. R kann ver- mittels des Triebes S auf und nieder geschraubt werden. Es versteht sich von selbst, daß die Spitze von M in die feuchte Kammer nach unten geht, wenn R nach oben geschraubt wird, und umgekehrt. Die Scliraiibe an R hat eine ziemlich feine Ganghöhe, und der Hebelarm ist ungefähr doppelt so lang als der Abstand von P bis zur Spitze der Glasnadel. Man kann somit sehr geringe Veränderungen zustande bringen. Der Drehpunkt P wird durch eine Kupferstange V getragen, welche an den Säulen T befestigt ist. Die Halter N kann man mit den Glasnadeln bequem von dem Instrumente nehmen, wenn die Glasstückchen, welche die Seitenspalten bedecken, weggenommen sind. Da die Nadeln M in verschiedener Höhe in den Nadelhaltern N befestigt werden können, kann man bei dem Apparat auch ver- schiedene Mikroskope benutzen, z. B. Zeiss Stativ /«, Leitz Stativ /, /ft, Ib etc. Auf kleine Stative ist nicht gerechnet, weil diese bei der bakteriologischen Untersuchung im allgemeinen nicht wohl anwendbar sind. 16 Schouten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. Der Abstand zwischen den Stützpunkten P ist so weit ge- nommen, daß Objekttische der größten Stative, und also selbstver- ständlich auch kleinere, dazwischen passen. Mit Absicht ist an beiden Seiten zwischen V und dem Mikro- skop ein großer Raum offen gelassen, durch Avelchen man die Hände stecken kann, falls das für eine Versetzung des Spiegels oder der Irisblende nötig wird. Es war eine zeitraubende Arbeit, die brauchbarste Form für die Glasnadeln auszuprobieren und eine Methode für die Anfertigung zu finden. Viele technische Schwierigkeiten kreuzten hierbei den Weg. Nach längeren Untersuchungen in dieser Richtung halte ich es für das beste, bei der Isolierung aller Organismen Glasnadeln zu gebrauchen, die an der Spitze zu einem Auge umgebogen sind. Jede Nadel ist an dem Teil, welcher sich über dem Stab befindet, 3 bis 4 mm dick; ungefähr über dem Drehpunkt P ver- jüngt sie sich zu + -^/.^ mm Dicke. Das letzte Ende aber, aus welchem das Auge geformt ist, hat eine bestimmte Dicke, die im Verhältnis zu der Größe des Auges steht, das daraus geformt ist. Für die kleinsten Mikroorganismen, z. B. stab-, kommaförmige und runde Bakterien, wird (Fig. 2j ein Auge (No. 2) verwandt mit einem äußeren Durchmesser von 9^t und einer Drahtdicke von 2"5^. Für die größten Zellen, z. B. einzellige Algen, Schwärmsporen von Algen und Pilzen , große Sporen und Conidien , Saccharomyceten, Infusorien etc., wird ein Auge (No. 4) angewandt mit einem äußeren Durchmesser von 50 jji und einer Drahtdicke von 10 ^a, für Mikro- organismen dazwischenliegender Größen ein Auge von 30 ^a äußeren Durchmessers bei einer Drahtdicke von 5 ^ (No. 3). Endlich wird noch bei der Isolation von Bakterien außer dem genannten kleinen Auge eine einfache spitz zulaufende Glasnadel gebraucht von 10 /^ Dicke (No. 1). Die Nadeln sind an dem Ende, welches in der Isolierkammer steckt, in einer Länge von + 3 mm etwas nach oben umgebogen. Die Befestigung der Isoliernadeln in dem Apparat geschieht auf folgende Weise. ^ Man setzt das Mikroskop auf den Isolierapparat, und zwar in seinen mittleren Stand , d. h. so , daß es vermittels der Schiebvor- ') Wer sich einen Isolierapparat anscbafl't, empfängt diesen mit Nadeln, die in den Nadelhaltern befestigt sind. Ich teüe hier absichtlich mit, wie dies geschieht. Man kann also, falls eine bricht, eine neue besonders be- stellen und selbst an dem Apparat befestigen. I XXII, 1. Schonten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. 1 7 richtung ungefähr ebenso weit nach rechts als nach links, nach vorne als nach hinten verschoben werden kann. Ebenso ist die Isolier- kammer mitten unter das Objektiv gestellt ; die losen Stücke, welche die Seitenspalten bedecken, sind abgenommen. Nun bringt man in die Nadellialter N Glaserkitt und legt darauf die Nadeln so, daß die umgebogenen Enden nach oben weisen, sich |Kj/L 1. beinahe mitten unter dem Objektiv berühren und sich etwas tiefer als der obere Rand der Isolierkammer befinden. Dann legt mau die losen Stücke wieder auf die Seitenspalten und ein Deckglas auf die Isolierkammer. Nun drückt man die Nadeln so tief in den Glaserkitt, daß die Enden bei einem ungefähr horizontalen Stand durch Bewegung der Triebe S (Fig. 1) die Unterseite des Deck- N^l ©^ N5 2 glases berühren können, aber auch mindestens 2 mm nach unten bewegt werden können. Man muß diese Bewegungen nicht allein vornehmen können , wenn die Isolierkammer sich mitten unter dem Tubus des Mikroskops befindet, sondern auch, w^enn sie so weit nach links oder rechts verschoben ist, wie dies für das Isolieren notwendig wird. Weiter dürfen die Enden, wenn sie das Deckglas berühren, nicht zu weit auseinander stehen, z. ß. auf eine Distanzweite von 300 ju, und sich nicht genau gegenüber stehen. Im letzten Fall be- stünde nämlich die Möglichkeit, daß sie bei einer gleichzeitigen Zeitschr. f. wiss. Mikroskopie. XXII, 1. 2 18 Schonten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. ober- und unterwärtsigen Bewegung ineinander greifen und breclien würden. Zum Schluß noch ein Hauptfaktor, auf den geachtet werden muß. Das Auge muß solch einen Stand haben , daß es , wenn es gegen das Deckglas angebracht ist, mit seinem ganzen Umriß das Deckglas berührt. Man kontrolliert dies in einem hängenden Tropfen, den man auf das Deckglas der Isolierkammer angebracht hat , mit der stärksten Vergrößerung. Wenn man das Auge in trockenem Zustande gegen das Deckglas bringt, kann man sicli unmöglich dar- über Sicherheit verschaifen. Befinden sich die Nadeln nun an der gewünschten Stelle, dann kann man, falls man vorsichtig zu Werke geht und sie nicht berührt, schon sofort mit der Isolierung beginnen. Wenn nach einiger Zeit der Glaserkitt hart geworden ist, ist selbstverständlich eine Ver- schiebung immöglich. Wir wir oben gesehen haben , braucht man beim Apparat 4 Nadeln und somit 4 Nadelhalter iV. Man tut gut, diese zu nume- rieren ; No. 1 und No. 4 werden rechts, No. 2 und No. 3 links im Apparat angebracht. Daß die Nadeln mit großer Vorsicht behandelt werden müssen, ist selbstverständlich. Ein Andrücken gegen das Deckglas können sie aber, da sie sehr elastisch sind, gut vertragen. Leider kann ich jetzt noch nicht den festgesetzten Preis des ganzen Apparates oder der besondern Nadeln mitteilen, und auch nicht die Verfertigungsweise der letzteren. Hoifentlich wird jedoch bald diese Lücke ausgefüllt werden. Eventuelle Anfragen werde ich indessen vorläufig gern entgegennehmen. Mit diesem Apparat ist man also imstande, sehr feine Bewegungen unter dem Mikroskop auszuführen. Bis jetzt noch sind die Versuche allein auf das Isolieren von Mikroorganismen beschränkt. Ich bin aber überzeugt, daß man mit dieser Methode vielerlei andere Ar- beiten wird verrichten oder doch bequemer machen können, z. B. das Sortieren von feinem Planktonmaterial, das Verfertigen von Dauerpräparaten solcher Mikroorganismen etc. Sind mir die schwie- rigsten Experimente (das Isolieren von Bakterien) geglückt, dann darf ich wohl erwarten , daß auch leichtere Versuche nicht miß- glücken werden. ^ ^) Als ich meine Methode schon ganz ausgearbeitet und bereits viele Versuche mit ihr angestellt hatte, bemerkte ich aus den historischen An- XXII, 1. Schouten: Reinkulturen einer untere!. Mikroskop isoliert. Zelle. 1 9 Das Isolieren. Die Deckgläser, welche hierzu gebraucht werden, sind 18x18 mm groß. Peinliche Sauberkeit ist selbstverständlich. Am besten bringt man sie zunächst einige Zeit in die bekannte Mischung von Bichromat- kalium und Schwefelsäure ; wenn es nötig ist, kocht man sie in dieser Mischung oder in heißem Seifenwasser auf. Nach tüchtigem Ab- spülen werden sie in Alkohol aufbewahrt. Will man nun isolieren, so beginnt man damit, einige Deck- gläser mit einem feinen Leinentuch, Avelches man mit ganz wenig Vaseline versehen hat, einzureiben. Mit einem andern reinen Tuch reibt man die Vaseline wieder so weit ab, daß das Deckgiäschen nur noch eben leicht beschlagen aussieht. Auch sorgt man für eine genügende Anzahl feuchter Kammern. Man verwendet hierzu nicht die gebräuclüichste Form, nämlich einen Ring auf einem Objektglas, sondern einen viereckigen Glasrahmen auf einem Objektglas. Die Seitenwände der Kammer sind 2 bis .3 mm hoch, 5 mm breit ; der Innenraum ist 14X14 mm. Man kann diese Kammern bequem selbst anfertigen, wenn man den Glasrahmen aus 4 losen Stücken macht. Man reibt sie ebenso wie die Isolierkammer von innen ein mit Vaseline, welches die Stäubchen, die hereinfallen könnten, fest- halten soll. Ebenso werden sowohl die Seitenwände der feuchten Kammer als die Isolierkammer vorher an der Oberseite mit Vaseline ver- sehen, die zur Abschließung mit den Deckgläschen notwendig ist. merkungen, die Apäthy in seinem Buch: Die Mikrotechnik der tierischen Morphologie Bd. I, Brannschweig (Bruhn) 189(j gibt, daß man schon in früheren Jahren allerlei Versuche gemacht hatte, um kleine Organismen (Diatomeen, kleine Crustaceen etc.) auf bequemere Weise unter dem Mikroskop bewegen und isoHeren zu können. Übrigens hat keine dieser Methoden den Erwartungen entsprochen, weil ihr Gebrauch zu viele Be- schwerden mit sich brachte und allein bei schwacher Vergrößerung an- wendbar war. Als ein Kuriosum sei hier allein die beste dieser Einrich- tungen genannt, die Hanks im Jahre 1877 konstruierte. Sie bestand aus einem Stück Bürstenhaar, dessen Spitze sich in der Mitte des Gesichts- feldes befand. Durch horizontale Bewegungen des Objekttisches wurden die Objekte in horizontaler Richtung, durch Auf- und Abwärtsbewegen des Beleuchtungsapparates in vertikaler Richtung transponiert. Man konnte einen Organismus dadurch isoheren, daß man ihn an der feuchten Spitze des Haares anklebte und ihn, wenn das Haar trocken geworden war, auf einem Gläschen auffing. 9* 20 Scheuten: Reinkultureneinerunterd. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. Jetzt nntersuclit mau erst , wie viel mau vou dem Material, woraus isoliert werdeu soll, in einen Tropfen einer ^/^prozeutigeu Kochsalzlösung- bringen muß , so daß nicht zu viel Zellen sich am Rand des Tropfens befinden. Es muß nämlich möglich sein, wie wir bald sehen werden, eine Zelle in einem ganz kleinen Tröpfchen aus dem großen Tropfen zu ziehen, ohne daß andere Zellen, wenigstens nicht in zu großer Zahl, mitgehen. Man zieht darum ein mit Vaseline eingeriebenes Deckgläschen dreimal durch die Flamme. Hierauf legt mau es auf die „Wechsel- kammer" (s. p. 32) so nieder, daß die Seite des Deckglases, die beim Ziehen durch die Flamme nach unten gekehrt war, sich auf der Unterseite befindet. Nun setzt man 4 Tropfen einer '^/^^prozen- tigen Kochsalzlösung auf das Deckglas, und bringt in jeden Tropfen mittels einer Platinnadel oder einer ganz feinen Platinöse verschiedene mit dem bloßen Auge kontrollierte Quantitäten des Materials (das man zu diesem Zweck in Bouillon oder auf einem festen Nährboden gezüchtet hat), und verteilt durch vorsichtiges Rühren die Zellen so gut wie möglich im Tropfen. Dann wird das Deckglas auf eine feuchte Kammer gelegt , auf deren Boden man , gegen die Vorder- oder gegen die Hinterseite (nicht in die Mitte, denn das könnte die Beobachtung hindern) ein Tröpfchen Wasser gelegt hat, und unter- sucht man, in welchem der 4 Tropfen das Material am besten ver- dünnt ist. Hierauf wird das Gläschen, auf welchem man isolieren will, zugerichtet. Man zieht es auch dreimal durch die Flamme, und legt es auf die Wechselkammer wie das vorige. Nun sterilisiert man eine Platinöse und setzt untereinander, gleich nahe der Mitte des Deckglases, und zwar an der linken Seite, 3 Tröpfchen der sterili- sierten Flüssigkeit, in der die Kultur entstehen soll. (Diese Tropfen nenne ich von jetzt ab einfach „Kulturtropfen".) Daneben, also rechts von der Mitte, setzt man auf + 2 mm Abstand von jedem Tropfen, auch untereinander, 2 Tropfen einer ^/^prozentigen Koch- salzlösung (weiterhin „Materialtropfen" genannt) und darunter einen Tropfen einer sterilisierten '^/^prozentigen Kochsalzlösung (Fig. 3).^ Man bringt immer zuerst die Kulturtropfen auf das Grläschen und dann die Materialtropfen, weil so am wenigsten Gefahr ist, daß das Gläschen noch nicht genügend abgekühlt ist. Schließlich bringt man in die Materialtropfen eine genügende Quantität des Materials, ^) Der Diameter der Tröpfchen darf nicht größer sein als + 1"5 mm. XXII, 1. Schonten: Reinkultureneinerunterd. Mikroskop isoliert. Zelle. 21 und legt das Deckgläseben auf eine der zugerichteten feuchten Kam- mern, ziir Verhütung einer Infektion, und zugleich um es an den Rändern mit Vaseline zu versehen. Nun legt man auf den Boden der Isolierkammer gegen die Vorder- oder gegen die Hinterseite (nicht in die Mitte!) ein Tröpfchen Wasser und geht dann zum Sterilisieren der Nadeln über. Für Bakterien gebraucht man links die Isoliernadel mit dem kleinsten Auge (No. 2), rechts die spitz zulaufende gerade Nadel (No. 1). Um diese zu sterilisieren, nimmt man die losen Seitenstücke, die die Spalten bedecken, von der Isolierkammer ab. Indem man nun die Schrauben, womit die Stäbe JV in befestigt sind, losdreht, holt 3 — 12. man N vorsichtig aus dem Apparat und hält die Spitzen der Glasnadeln zunächst in ein Fläschchen mit starker Schwefelsäure und dann etwas tiefer in ein Fläschchen mit Ammoniak. Man taucht die Spitze immer etwas tiefer in das Ammoniak als in die Schwefelsäure, da es sonst möglich ist, daß ein Teil der Schwefelsäure nicht genügend neutra- lisiert wird und dann nachher zu der Spitze der Nadel hin diffundiert. Dadurch könnte die zu isolierende Zelle beschädigt werden, was mir im Beginn meiner Versuche, als ich auf diese Einzelheit nicht achtete, oft vorkam. Dann bringt man die Nadeln wieder auf ihren Platz und legt die losen Seitenstücke auf die Spalten. Bevor man diese schließt, legt man das Deckgläschen, auf dem isoliert werden soll („Isolierdeckgläschen"), schon wieder auf die Isolierkammer (wobei man wohl darauf zu achten hat, daß nicht eine der Nadeln einen 22 Schonten: lleinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. Materialtropfen berührt). Je eher nämlich die Nadeln vor Lnft- infektiou (s. p. 36) geschützt werden, desto besser. Das Schließen selbst geschieht mit Olivenöl, welches durch Diapalm so dickflüssig gemacht ist, daß es nach z. B. zwei Tagen noch nicht aus den Spalten herausgeflossen sein darf. Es wird vor dem Gebrauch um- gerührt; man läßt es von einem platten Spatel in den Spalt fließen. Nun geht man zum eigentlichen Isolieren über. Man wartet noch eben, bis das Deckglas ganz beschlagen ist mit kleinen ab- gerundeten Tröpfchen.^ In der Figur 4 (u. fi".) sind diese Konden- sierungströpfchen deutlichkeitshalber weggelassen. Ist man so weit, und ist also die Isolierkammer mit Wasserdampf gesättigt, dann taucht man die Spitzen der Nadeln bei schwacher Vergrößerung einige Male in den Tropfen steriler '^^prozentiger NaCl-Lösung. Das geschieht um sie von Ammoniaksulfat zu befreien, obgleich ich nicht glanbe, daß dies schädlich auf die zu isolierende Zelle einwirken kann,'- und um das Auge der linken Nadel mit NaCl-Lösung zu füllen. Hierauf stellt man vermittels der Schiebebewegung von B (Fig. 1) das Mikroskop so, daß das Auge der linken Nadel, während es das Deckglas beinahe berührt, bei stärkster Vergrößerung genau in die Mitte des Gesichtsfeldes kommt. Die rechte Nadel wird um drei Schraubgänge nach unten gedreht. Hierauf stellt man vermittels der beweglichen Objekttafel bei schwacher Vergrößerung die Isolier- kammer so, daß das Auge beinahe den Rand eines Materialtropfens berührt, und zwar den Rand, der dem gegenüberliegenden Kultur- tropfen zugekehrt ist (Fig. 4). Natürlich muß man dafür sorgen, daß bei diesen Verschiebungen die linke Nadel nicht mit einem der Tropfen in Berührung kommt. Bei der rechten Nadel ist das un- \) Daß die größeren Material- und Kulturtropfen und die kleinen Kondensierungstroixfen alle abgerundet sind , ist eine Folge von dem Ge- brauch der Vaseline. Auf gewöhnlichen Deckgläsern würden alle diese Tropfen unregelmäßige Konturen haben und mehr oder weniger ausfließen und untereinander zusammenfließen, wodurch das ganze Isolationsverfahren unmöglich sein würde. Indessen darf nur sehr wenig Vaseline auf dem Deckglas nach dem Ausreiben zurückbleiben , da sonst beim Schieben des Auges gegen das Deckglas die überflüssige Vaseline leicht in Form kleiner Stäbchen in die isolierten Tropfen hineingelangt, was zu Verwechslung mit Bakterien Anlaß geben könnte. -) Nach MiyUEL, Les organismes vivants de l'atmosphere, sind nicht weniger als 250 g Ammonium sulf. nötig, um auf 1 1 Bouillon entwick- lungshemmend einzuwirken; er rechnet es demnach unter die sehr schwach antiseptischen Körper. XXII, 1. Scliüuten: Reinkultureneiner unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. 23 möglich, weil sie ganz nach unten gedreht ist. Nun gebraucht man die stärkste Vergrößerung; um alles an den richtigen Platz (Fig. 5) im Gesichtsfeld zu bekommen, wird bisweilen noch eine kleine Ver- schiebung des Mikroskops oder der Nadel, die man, weil sie das Deckglas nicht berührt, nur so eben sieht, notwendig sein. Man sucht nun am Rand des Tropfens entlang, bis man eine Bakterie, die man isolieren will, sieht. Wir nehmen au, daß wir diese in einem Teile des Tropfenrandes finden, wo sich nicht viel andere Bakterien aufhalten. Können wir solch einen Teil nicht in dem einen Materialtropfen finden , so suchen wir in dem anderen. Dann bringt man das äußerste Ende des Auges der Nadel (in Fig. 4 bis 7 durch eine kleine halbkreisförmige Linie wiedergegeben) gegen das Deckglas und berührt damit eben den Tropfenrand. Dadurch wird ein wenig Flüssigkeit aus dem Tropfen gezogen (Fig. 6). Sieht man, daß die betretfende Bakterie mitgegangen ist, dann verschiebt man die Isolierkammer ein wenig, wodurch ein kleines Tröpfchen mit der Bakterie darin sich vom großen Tropfen loslöst (Fig. 7). Hierzu sind sehr kleine Bewegungen notwendig; man kann diese noch besser als durch Verschiebung der Isolierkammer bekommen, wenn man seitlich gegen die Mikrometerschraube des Mikroskops drückt. Nun bewegt man die linke Nadel ein Avenig nach unten und untersucht, ob man die eine Bakterie, und nicht mehr als sie, in dem Tröpfchen liegen sieht. Ist das so, dann bringt man das Auge der linken Nadel eben gegen das Deckglas auf einen Platz dicht bei dem Tröpfchen mit der isolierten Bakterie. Dadurch soll das Auge einen Teil seines Inhalts auf das Deckglas absetzen (Fig. 8j, und folglich weniger Flüssigkeit enthalten (sei es auch nur eine Zeitlang, denn allgemach zieht es wieder Wasserdampf an sich, mit dem die Isolierkammer gesättigt ist). Wenn man dann das Auge wieder in den Tropfen mit der isolierten Bakterie' bringt, und darauf wieder nach unten bewegt, wird die Bakterie meistens aus dem Tröpfchen verschwunden und in das Auge übergegangen sein. Scheint das noch nicht geschehen zu sein, dann muß die beschriebene Be- wegung wiederholt werden. Diese Bakterie muß nun in eines der Kulturtröpfchen gebracht werden. Zu diesem Zweck nimmt man statt der starken Vergrößerung die schwache und verschiebt die Isolierkammer so weit nach rechts, daß das Auge der linken Nadel, wenn diese nach oben bewegt wird, zwischen zwei Kulturtröpfchen, und zwar ganz nahe am Rand des 24 Schonten: lieinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. einen der beiden, ankommt. Man versucht dies dadurch, daß man das Auge bis dicht an das Deckglas bringt. Erst wenn man die schwache Vergrößerung wieder mit der starken gewechselt hat, bringt man das Auge gegen das Deckglas. Dieses setzt dadurch ein Tröpf- chen ab (Fig. 9), in dem sich wahrscheinlich die isolierte Bakterie befindet. Ist das nicht der Fall, dann setzt man mit dem Auge neben das erste Tröpfchen ein zweites, und wenn notwendig, mehrere, bis man in einem derselben die bewußte Bakterie liegen sieht. Auf dieselbe Weise isoliert man zwei andere Bakterien, die man ebenso jede neben ihrem Kulturtropfen deponiert. Nun bringt man die isolierten Bakterien in die Kulturtropfen, Dies geschieht nicht vermittels der augförmigen linken Nadel, welche man bisher gebraucht hat, sondern mit der spitzen rechten Nadel. Man dreht bei schwacher Vergrößerung die linke Nadel um drei Schraubgänge ^ nach unten, die rechte Nadel in die Höhe, und bringt diese, vermittels der Schiebevorrichtung B genau unter eines der Tröpfchen, worin sich eine isolierte Bakterie befindet. Jetzt vertauscht man die schwache Vergrößerung mit der stärksten, imd bringt die Spitze der rechten Nadel bis zur Berührung des Deckglases in das Tröpfchen. Dann verschiebt mau die Isolierkammer, oder besser noch man drückt gegen die Mikrometerschraube des Mikroskops, so daß die Spitze der Nadel das Tröpfchen mit der Bakterie in den Kulturtropfen zieht. Während dies geschieht, muß man die Bakterie gut im Auge behalten. Das ist möglich, weil die rechte Nadel in eine Spitze ausläuft, die die Bakterie nicht so leicht dem Auge ent- zieht als ein augförmig umgebogenes Ende, das mehr Platz einnimmt. Im Moment des Zusammenfließens (Fig. 10) der beiden Tropfen ist man also sicher, daß die isolierte Bakterie wirklich in den Kultur- tropfen gelangt ist. Meistens kann man sie darin liegen sehen. Macht man von einem festen Kulturtropfen, z. B. Gelatine, Gebrauch, dann sieht man das Tröpfchen mit der Bakterie an der Gelatine liegen (Fig. 11). Auf dieselbe Weise werden die anderen isolierten Bakterien in ihre Kulturtropfen gebracht. Wir haben oben die Annahme gemacht, daß die isolierte Bakterie bei ihrer Entfernung aus dem Materialtropfen sich in einem Teil des ^) Drei Schraubgänge genügen, um zu verhindern, daß die Spitze der Nadel während der Verschiebungen der Isolierkammer die Unterseiten der Tropfen berühren kann. XXII, 1. Schouten: Reinkultureneiner unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. 25 Tropfenrandes befand, wo nicht viel andere Bakterien sich aufhielten. Allein in diesem Falle darf man auf die beschriebene AVeise 7AI Werke gehen, und also, sobald man gesehen hat, daß man eine Bakterie aus dem Materialtropfen geholt hat, diese sofort in dem Auge der linken Nadel auffangen und in nächster Nähe des Kultur- tropfens deponieren. Vorausgesetzt nun aber, daß die Bakterie sich in ihrem Material- tropfen in einem Teil befand, wo auch viele andere Bakterien in nächster Nähe waren (hierfür besteht z. B. große Möglichkeit, wenn die ursprüngliche Flüssigkeit nicht gut verdünnt ist), dann ist es sehr leicht möglich, daß sich in dem isolierten Tröpfchen zwar nur eine Bakterie befindet, aber daß im Auge der Nadel auch eine oder gar mehrere Bakterien vorkommen. In diesem Falle kann es daher auch passieren, daß in dem Tröpfchen, welches man neben dem Kultur- tropfen absetzt, nicht eine, sondern mehrere Bakterien sich befinden. Nun könnte man meinen, daß das so schlimm nicht sei, da man dann ja einfach das Tröpfchen mit den Bakterien neben dem Kultur- tropfen liegen lassen kann, um darauf eine andere Bakterie zu isolieren. Man tut aber gut, im Auge zu behalten, daß ein Tropfen auf dem Deckglas oft im Verlauf der folgenden Stunden ein M^enig auseinander fließt, so daß die verschiedenen Bakterien dann in den Kulturtropfen gelangen würden. Es ist darum besser, in solch einem Fall vorsichtiger zu arbeiten. Wenn mit der linken Nadel eine Bakterie aus dem Materialtropfen isoliert ist, und man Grund hat zu ver- muten, daß in dem Auge der Nadel noch andere Bakterien sitzen, so bringt man einfach in der Nähe des isolierten Tropfens das Auge so oft gegen das Deckglas , bis alle Flüssigkeit mit den eventuell darin befindlichen Bakterien auf dem Deckglas abgesetzt ist (Fig. 12). Darauf bringt man mit schwacher Vergrößerung das Auge in den Tropfen ^/^ prozentiger Kochsalzlösung, um es noch einmal abzuspülen und sogleich wieder mit Flüssigkeit zu füllen, und dann erst bringt man die isolierte Bakterie auf die oben beschriebene Weise in ihren Kulturtropfen. Es ist wohl unnötig zu sagen, daß jeder, der mit dieser Methode arbeitet, von selbst allerlei kleine Einzelheiten durch die Praxis lernt. Hat man z. B. mit einem Tropfen zu tun, in dem sich am Rand ent- lang entweder durch ungenügende Verdünnung oder durch zufällige Umstände so viel Bakterien befinden, daß es beinahe unmöglich ist eine zu isolieren, und hat man dann weiter aus dem Materialtropfen ein Tröpfchen isoliert, worin sich nicht eine, sondern zwei oder mehr 26 Bchouten: Reinkultureneinerunterd. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. Bakterien befinden, von denen eine die gesuchte ist, dann kann man das Auge der linken Nadel erst in dem Tropfen '^j^ prozentiger Koch- salzlösung abspülen und es dann, nachdem man es auf die bekannte Weise von ein wenig Flüssigkeit entlastet hat, in das Tröpfchen mit jenen Bakterien bringen. Dadurch werden einzelne Bakterien in die Flüssigkeit des Auges übergehen und vielleicht bleibt gerade die eine gesuchte zurück; ist das nicht der Fall, dann kann man die Flüssigkeit aus dem Auge in Tropfen auf das Deckglas absetzen, und dabei geschieht es leicht, daß sich die Bakterien scheiden, indem sie in verschiedene Tröpfchen gelangen. Sobald man die gewünschte Bakterie in einem Tropfen abgesondert liegen sieht, spült man das Auge in dem Kochsalztropfen ab, und transportiert die Bakterie. Dergleichen besondere Fälle könnte man natürlich noch mehr beschreiben; wir wollen es aber hierbei bewenden lassen, weil die Praxis in dieser Beziehung die beste Lehrmeisterin ist. Durch einige Übung bringt man es recht bald so weit, daß, wenn das Material ungefähr die richtige Verdünnung hat (ist das nicht der Fall, dann kann man Avohl auch isolieren, aber nicht so bequem), man in ungefähr 5 Minuten eine Bakterie aus dem Material- tropfen isoliert und in den Kulturtropfen bringt. Es ist natürlicli nicht nötig, die Nadeln nach dem Isolieren jeder Zelle aufs neue zu sterilisieren; das muß allein geschehen, wenn man sie einige Zeitlang nicht gebraucht hat, und ebenso wenn man beim Isolieren einen Fehler gemacht hat, der es als wahr- scheinlich erscheinen läßt, daß sie durch Bakterien verunreinigt sind (z. B. wenn die rechte Nadel, auf die schließlich alles ankommt, durch Unglück in den Materialtropfen gekommen ist). Sind drei Bakterien transponiert, dann läßt man, wenn man noch mehrere isolieren will , das Deckglas noch auf der Isolier- kammer liegen, bis man ein zweites Deckgläschen in Bereitschaft gestellt hat. Wenn man ein Deckgläscheu von der Isolierkammer wegnimmt, tut man gut, mit Vorsicht zu Werke zu gehen. Hebt man es zu schnell auf, dann wird das Öl, das die Seitenspalten abschließt, in die Isolierkammer gesogen und die Unterseite des Deckglases ver- unreinigt. Man steckt darum eine platte , feinspitzige Pinzette zwischen das Deckglas und die Wand der Kammer und macht erst eine Öffnung in die Vaseline, die zur Abschließung dient. Erst darauf hebt man das Deckglas vorsichtig auf. XXII, 1. Schonten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop Isoliert. Zelle. 2 7 Jedes Deckglas, auf dem man isoliert hat, wird auf eine feuchte Kammer gelegt. Man kann, um Verdunstung der Kulturtropfen zu verhüten, auf den Boden einen kleinen Wassertropfen bringen, aber immer gegen die Wand, welche sich bei den Materialtropfen befindet. Der Wasserdampf, welcher sich aus diesem Tröpfchen, besonders in einem Brutschranke, entwickelt, wird nämlich meistens im stärksten Maße kondensiert auf dem Teil des Deckglases, welcher sich darüber befindet, hier also zwischen den Materialtropfen. Geschähe das zwischen den Kulturtropfen, dann könnten diese zerfließen und die Kultur also mißglücken. Da ich indessen während meiner Versuche bemerkte, daß hängende Tropfen, sei es von Bouillon, Nährgelatine oder anderen Flüssigkeiten, nach einiger Zeit mehr oder weniger sauer werden (eine Tatsache, die, soweit ich weiß, noch nicht beobachtet ist, und worüber ich bald eine Mitteilung veröffentlichen will), ist es weit besser, auf den Boden der feuchten Kammer ein kleines Stück- chen Filtrierpapier (etwa 3X8 mm groß), getränkt mit einer 2prozentigen KOII-Lösung, zu legen. Dadurch wird das Sauerwerden, das meistens eine entwicklungsliemmende oder gar tödliche AVirkung auf die isolierten Bakterien hat, verhütet. Ein Tropfen KOH- Lösnng leistet keine Dienste, da er zwischen dem Boden und den Seitenwänden der feuchten Kammer zerfließt. Nach dem Gebrauch werden die Kammern gut gereinigt und vom überschüssigen KOH befreit, da sonst bei fortwährendem Gebrauch die Konzentration zu hoch werden würde, und ein Austrocknen der hängenden Tropfen zu fürchten wäre. Die benutzten feuchten Kammern werden in eine gehörige Temperatur gebracht. Wenn diese Temperatur höher ist als 25*^ C, muß das Deckgläschen, das schon vermittelst V^aseline auf der feuchten Kammer befestigt ist, außerdem noch an zwei Seiten mit Paraffin bestrichen werden, was man am bequemsten so macht, daß man sie aus einem gläsernen Tropfgläschen ausfließen läßt. Beim Gebrauch von Vaseline allein gleitet das Gläschen, wenn dieses flüssig wird, ganz von seinem Platz. Wenn als Kulturtropfen ein fester Boden angewandt wurde, kann die Entwicklung der Kolonie mit starker Vergrößerung beobachtet werden, weil dieselbe sich am Rande vollzieht. Untersuchen wir nun die Isolierung größerer Organismen. Ehe man mit der Isolierung beginnt, mißt man die Größe der Zellen, um zu bestimmen, mit welcher Nadel isoliert werden muß. 28 Schonten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. Haben die Zellen eine solche Größe , daß sie am besten mit Nadel No. 3 transportiert werden, dann setzt man alle Tropfen auf das Deckglas , wie es oben für Bakterien beschrieben worden ist. Werden aber die Zellen am besten mit Nadel No. 4 transportiert, dann setzt man, da diese Nadel rechts im Apparat angebracht ist, die Kulturtropfen an die rechte , die anderen Tropfen an die linke Seite, so daß die Zellen mit No. 4 isoliert und transportiert, mit No. o in die Kulturtropfen geschoben werden. Wir wollen die Isolierung einer großen Zelle nun nicht mehr ausführlich beschreiben. Die Methode ist in der Hauptsache dieselbe wie die, welche wir oben in extenso für Bakterien mitgeteilt haben; die Änderungen lernt jeder selbständig bei der Ausführung. Auf einige bedeutungsvolle Sachen wollen wir aber noch weisen. Zunächst auf den besonderen Nutzen des sterilen Kochsalz- tropfens. Dieser kann uns hier einen besonderen Dienst erweisen, wenn die ursprüngliche Flüssigkeit nicht genügend verdünnt ist, oder wenn an der zu isolierenden Zelle (Hefezelle, Scliimmelspore etc.) eine Bakterie fest zu sitzen scheint. In solchen Fällen kann man den Inhalt des Auges der Nadel, in dem sich die zu isolierende Zelle befindet, gleichsam darin abspülen, wobei die festsitzende Bakterie vielleicht abgelöst wird , und die überflüssigen Bakterien zurück- bleiben. Auch machen wir darauf aufmerksam, daß bei der Isolierung großer Zellen im allgemeinen mit anderen Vergrößerungen gearbeitet wird, als bei der Isolierung von Bakterien. Es ist z. B. anzu- raten, die Arbeiten, die wir in Figur 5 bis 7 dargestellt haben, besonders wenn die zu isolierenden Zellen sehr groß sind, und also die Nadel mit dem größten Auge angewandt wird, nicht mit einer Immersionslinse , sondern mit einem mehr oder weniger starken Trockensystem zu verrichten, z. B. Leitz 6 bis 8, Zeiss E oder F. Man kann selbst noch schwächere Vergrößerungen gebrauchen, wenn man sicher ist, daß der Materialtropfen von Bakterien nicht, oder doch sehr wenig, verunreinigt ist, und man also sehr wenig Möglich- keit hat, außer der zu isolierenden Zelle noch andere Zellen, z. B. Bakterien aus dem Tropfen herauszuziehen. Das Immersionssystem gebraucht man hier nur, um zu kontrollieren, ob man nicht mehr als die eine gewünschte Zelle isoliert hat, und es ist wohl ratsam, bei dieser Kontrolle die isolierte Zelle in dem Tröpfchen gut hin und her zu bewegen, so daß sie von allen Seiten gut beobachtet werden kann. Schimmelsporen und Conidien deponiert man immer XXII, 1. Schonten: ßeinkultureneinerunterd. Mikroskop isoliert. Zelle. 29 bei schwacher Vergrößerung in die Mitte des Kultiirtropfens ; bei dem Keimen kann das Mycelium sich dann nach allen Seiten aus- breiten, ohne aus dem Tropfen herauszutreten, was natürUch ge- schehen würde, wenn die keimende Zelle am Rande läge. Jetzt eine Bemerkung, die soAvohl für die Isolierung größerer Zellen als auch Bakterien gilt. Man kann die zu isolierende Zelle noch auf eine andere, als iu Figur 5 und 6 beschriebene Weise aus dem Materialtropfen herausbringen, wenigstens .in einzelnen Fällen. Wenn man ein gut verdünntes Bakterienmaterial hat, kann man auch eine Bakterie isolieren, welche etwas vom Rande des Tropfens entfernt liegt, indem man nämlich das Auge nicht an den Rand, sondern sofort in den Tropfen an den Platz der bewußten Bakterie bringt. In vielen Fällen wird es glücken, diese dann aufzufangen. Das geht jedoch nicht bei einer Bakterie, die sich weit vom Rand entfernt befindet, also in einem dickeren Teil des Tropfens, denn in solchem Fall ist die Möglichkeit zu groß, andere Bakterien in das Auge der Nadel zu bekommen, die sich in tieferen Schichten des Tropfens befinden und die man nicht mit dem Immersionssystem sehen kann. Sehr gut geht aber dieses Auffangen, selbst mitten aus dem Tropfen, bei großen Zellen mit schwacher Vergrößerung. In diesem Falle darf die Flüssigkeit nicht zu stark mit Bakterien verunreinigt sein. Nicht geringe Schwierigkeit bereiten Zellen , die sich an dem Deckglas mehr oder weniger festkleben, was ja Bakterien (wahr- scheinlich vermittels ihrer Cilien) wohl gelegentlich tun. Man kann sie oft nicht aits dem Tropfen herausbringen. Am bequemsten sind die Bakterien zu isolieren, welche in Be- wegung sind , was man a priori gewiß nicht erwarten würde. Man sucht einfach einen Platz am Rand des Tropfens auf, wo die Bakterie nach ihrer Bewegung vermutlich entlang kommt, um in dem Moment die Bewegung zu vollziehen , die in Figur 6 gezeichnet ist. Fast immer wird es glücken, die Bakterie in dem gelegten „Hinterhalt" zu packen. Sehr bequem sind auch Bakteriensporen zu isolieren, wenigstens wenn man einen einfachen Kunstgriff anwendet, der darin besteht, daß man das Ende der Nadel mit einer sehr dünneu Paraffinschicht überzieht, und zwar dadurch, daß man es in eine lüprozentige Lösung von Paraffin in Petroleumäther taucht. Dann bleiben die Bakteriensporen außerordentlich gut an der Nadel haften ; man kann sie sogar mit der punktförmigen Nadel No. 1 isolieren. Die Er- 30 Schonten: Reinkultureneiner unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. klärung dieser Tatsaclie ist natürlich in einer besonderen Adhäsion zwischen der Paraffin und der Sporenwand , die eine besondere chemische Struktur hat, zu suchen. — Wir liaben gesehen , daß das Material , woraus isoliert wurde, immer in physiologischer Kochsalzlösung verteilt war. Aus zwei Ur- sachen habe ich diese Flüssigkeit gewählt : zunächst wegen seiner geringen Viskosität. Aus Figur 6 und 7 ist es ersichtlich, daß die kleine Flüssigkeitsmenge mit der isolierten Zelle , wenn sie aus den größeren Materialtropfen gezogen ist , sich als ein selbständiges Tröpfchen loslöst. Das würde nicht möglich sein , wenn man es mit einer viskosen Flüssigkeit zu tun hätte. ^ Zweitens liegt ein großer Vorteil darin, daß Tröpfchen einer Kochsalzlösung nicht ver- dampfen 5 man kann diese, mit den darin sich befindenden Bakterien, z. B. 24 Stunden auf der Isolationskammer lassen , und dann haben sie noch dieselbe Größe. Tröpfchen einer anderen Flüssigkeit werden während der Beobachtung kleiner, um nach sehr kurzer Zeit beinahe ganz zu verschwinden. Eine vollkommene Erklärung dieses Phäno- mens wage ich noch nicht zu geben ; sicherlich spielen hier aber, wie zahlreiche Versuche mir lehrten , die wasseranziehende Kraft des Kochsalzes und die Temperatur des Apparates selbst und der Umgebung eine Hauptrolle. Man isoliere, wenn möglich, aus frisch hergestelltem Material, z. B. aus Kulturen, welche nicht älter sind als 24 Stunden, ins- besondere wenn man es mit Bakterien zu tun hat. Es ist mir näm- lich wahrscheinlich , daß oft ein ziemlich großer Prozentsatz der Bakterien in einer Kultur tot oder beinahe tot, jedenfalls nicht mehr entwicklungsfähig ist. Das kann jedoch nicht von allen Bakterien gesagt werden ; ich habe gearbeitet mit Arten (z. B. die Fäces- bakterien von Kohlbrugge , worüber später gehandelt werden soll), wobei alle isolierten Bakterien sofort Kolonien gaben, und mit andern Arten, bei denen die Isolation einer ziemlich großen Anzahl Zellen kein Resultat ergab. Bei Hefezellen und selbstverständlich auch bei Pilzsporen tritt diese Schwierigkeit nicht zutage. Man untersuche immer, ehe man mit dem eigentlichen Isolieren ^) Es kann aber auch vorkommen, daß gewisse Flüssigkeiten zu wenig viskos sind, so daß sie sich über die Unterseite des Deckglases ausbreiten. Das ist z. B. der Fall mit gewöhnlichem Serum. Wenn man davon Kulturtropfen nimmt, findet man diese nach einiger Zeit untereinander zerflossen. Man verdünnt es daher mit Wasser oder mischt es mit ein wenig Gelatine. XXII, 1. Schouten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. 31 anfängt , in welcher Nährflüssigkeit der Organismus , der isoliert werden soll , am besten wächst. Zu diesem Zweck richtet man mehrere Deckgläschen, jedes mit einem Materialtropfen und mit z. B, 5 Kulturtropfen verschiedener Nährlösungen , und bringt in dem Isolierapparat , vermittels einer der augförmigen Nadeln , bei schwacher Vergrößerung, ein ganzes Auge, gefüllt mit Zellen, in jeden Kulturtropfen. Die Deckgläschen werden dann auf ge- wöhnliche feuchte Kammern gelegt, wenn nötig in den Brutschrank gestellt, und am folgenden Tage kontrolliert. Diese vorläufigen Ver- suche sind bequem auszuführen , und kosten nicht viel Zeit. Be- ginnt man aber sofort mit dem Isolieren, dann tut man oft viel Arbeit umsonst. Die Gründe für den Gebrauch zweier Nadeln sind folgende. Irgendwelche Umstände könnten Veranlassung sein, daß sich in dem Auge der Nadel , mit der eine Zelle isoliert wurde , noch eine Bakterie festsetzte, obgleich es sehr selten vorkommt, wenn man mit reinen , gut sterilisierten Nadeln arbeitet , wenn das Material ge- nügend verdünnt ist , und man nur dafür sorgt , daß die Nadel niemals zu tief im Materialtropfen steckt. Dann könnte die Bakterie wohl einmal mit der isolierten Zelle zusammen in dem Kulturtropfen landen, und es würde keine Keinkultur entstehen. Wenn man eine große Zelle, z. B. von Hefe, isolierte, würde man den Fehler später wohl bemerken , aber bei Bakterien könnte große Verwirrung ent stehen. Darum haben wir lieber mit zwei Nadeln arbeiten wolleii. Hat man wirklich beobachtet, daß man nur eine Zelle isoliert hat und neben dem Kulturtropfen deponiert , dann wird diese weiter in den Kulturtropfen mit der zweiten Nadel transponiert, über deren vollkommene Reinheit man sieher sein kann. Wenn man nach einiger Zeit sieht, daß die isolierte Zelle sich in dem Kulturtropfen vermehrt hat, muß in ein gewöhnliches Röhr- chen übergeimpft werden. Hat man einen festen Kulturtropfen ge- braucht, so wartet man, bis die Kolonie mit bloßem Auge sichtbar ist. Für die Übertragung kann man von einem einfachen kleinen Apparat, der „Wechselkammer", Gebrauch machen, die schematisch und im Durchschnitt in Figur 13 abgebildet ist. Auf einem Fuß Ä, der mit Blei beschwert ist, stehen zwei Säulchen i?, von 10 cm Höhe. Auf diesen ist ein Objektglas C mit einer feuchten Kammer vermittels Siegellack befestigt. In der Mitte ist eine Öffnung D, deren Durchmesser 15 mm beträgt. Die Öff- 32 Schonten: Reinkultureneineruntercl. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. nimg kann durch ein Glasplättchen jE", das ganz mit Vaseline be- strichen ist, abgeschlossen werden, wenn man es darunter schiebt. Dieses Plättchen hat in der Mitte eine Öffnung, worunter ein hohler kupferner Knopf O befestigt ist. In diesen Knopf bringt man einen Tropfen Wasser, so daß nach Abschließung der Kammer von unten der Raum mit Wasserdampf gesättigt ist. Auf die feuchte Kammer, welche ebenfalls von innen mit Vaseline bestrichen ist , um von Infektion durch Stoffteilchen nicht belästigt zu werden, legt man das Deckglas F ^ auf dem isoliert ist. Man kann nun sehr bequem, wenn man E weggeschoben hat, von unten, durch die Öffnung hin, B D G E C B A 13. V mit einer Platiunadel aus dem Kulturtropfen in ein Röhrchen über- impfen. Dieser kleine Apparat hat den Vorteil, daß das Deckgläschen vollkommen festsitzt, daß Infektion von außen während dieser Mani- pulation beseitigt wird , und daß das Verdampfen der Tropfen auf dem Deckgläschen mehr verhindert wird , was nicht der Fall ist, wenn mau es einfach in eine Deckglaspinzette klemmt. Der Apparat findet auch , wie wir oben sahen , bei der Ver dünnung des Materials und der Herstellung der Isolierdeckgiäschen Verwendung. Sollte es vielleicht für einige Mikroorganismen aus dem einen oder andern Grunde erwünscht sein, daß sie nach der Isolation sich nicht in einer feuchten Kammer , sondern direkt in einem Röhrchen oder XXII, 1. Schonten: Reinkultureneinerunterd. Mikroskop isoliert. Zelle. ;i3 Kolben weiter entwickeln, so kann man folgendermaßen zu Werke gehen. Man isoliert in einem flüssigen Knlturtropfen und bringt sofort das Gläschen anf die Wechselkammer. In einem sterilisierten Kapillarglasröhrchen (+ 1 cm lang, Lumenweite + ^j^ mm), oder in einem sterilisierten Stückchen Filtrierpapier (+ 3X6 mm) , von dem man immer Vorrat haben muß , wird dann vermittels einer sterilisierten Pinzette der Kulturtropfen aufgesogen und sofort in das Röhrchen oder den Kolben gebracht. Anwendungen. Natürlich bestanden die ersten Anwendungen darin , daß ich Reinkulturen von allerlei Mikroorganismen züchtete, auch von solchen, bei denen das Isolieren nach der Koch sehen Methode mit mehr oder weniger Schwierigkeiten verbunden ist. Von den letzteren nenne ich die Saprolegniaceen, die, wie bekannt , meistens in Wasser vor- kommen, welches von Bakterien wimmelt, was zur Folge hat, daß Kulturplatten oft so stark durch überwuchernde Bakterien verun- reinigt sind, daß ein Isolieren des langsam wachsenden Pilzes un- möglich gemacht wird. Es kostete jedoch nicht viel Mühe, um nach der beschriebenen Methode aus sporenhaltigem Material (besonders wenn die Sporen noch nicht lange aus dem Sporangium heraus- getreten waren) eine Spore zu isolieren, die nicht mit Bakterien ver- unreinigt war, und daraus eine Reinkultur zu züchten. Zwei Anwe'ndungen möchte ich noch ausführlich beschreiben, und zwar weil dabei meine Methode in der Tat die einzige war, die zu einem Resultate führte. Beide betretfen die Frage der Pleomorphie. Eine Auseinandersetzung von dem, was über diese belangreiche Frage geschrieben ist, und eine Aufzählung der verschiedenen Beob- achtungen, die damit zusammenhängen, würde Stotf genug geben für ein ganzes Buch. Ich will mich darum in diesem engen Rahmen einer ausführlichen Besprechung dieser Frage enthalten, und nur zu zeigen versuchen, daß für ein abschließendes Studium dieses Problems, die bisher gebrauchten technischen Hilfsmittel unzureichend sind, und eine Methode wie die oben beschriebene unbedingt notwendig ist. Dabei ist die Benennung „Pleomorphie" als ein Kollektivbegritf aufzufassen, unter den alle beobachteten Variationen von Bakte- rien fallen. Zeitsclir. f. wiss. Mikroskopie. XXII, 1. 3 34 Schonten: Reinkultureneiner unter cl. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. Bei den Untersuchungen von Nägeli, Zopf u. a., welche die gewaltigsten Übergänge zwischen allen möglichen Formen wahr- nahmen, brauchen wir nicht stehen zu bleiben, da sie nicht mit Reinkulturen angestellt und also in gewissem Sinne wertlos sind. Ganz richtig sagt darum Migula^, mit Bezug auf die Versuche von Zopf, wo er über Arten spricht, die in Reinkulturen gezüchtet sind: „Eine so weitgehende Vielgestaltigkeit ist niemals beobachtet worden." Aber zwischen Pleomorphie in diesem Sinn und einem absoluten Konstantsein der Form besteht ein großer Unterschied. Zahllos sind die Versuche, welche ernste und tüchtige Forscher mit Hilfe von Reinkulturen gemacht haben, bei denen die Formen der Bakterien doch ineinander übergingen. Man hat Kokken sich in Stäbchen ver- ändern sehen, Stäbchen in Vibrionen, diese wieder in Kokken etc., und das alles unter veränderten Umständen, die nicht so abnormal waren, daß sie nicht auch in der Natur hätten vorkommen können. Was hat man von solchen Versuchen zu halten? Viele Forscher nehmen sie als wahr an und schrecken doch vor einer konsequenten Anwendung der Resultate zurück, die darin bestehen muß, daß man die ganze Einteihmg der Bakterien in Kokken, Stäbchen etc. fahren läßt. Aber damit würde ein großer Teil des Gebäudes der Bak- teriologie fallen. Eine Folge ist, daß man in den meisten Handbüchern einer gewissen Unsicherheit über diese Frage begegnet. Mau fürchtet sie anzufassen, redet um die Dinge herum und kommt zu dem billigen Schluß, daß die Wahrheit wohl so etwa in der Mitte liegen müsse. Aber mit diesem Ausweg ist wenig getan. Doch gibt es einzelne Forscher, die wohl zu sagen wagen, was sie von den Dingen halten, und die in scharf umrissenen Zügen an- geben , inwieweit sie die Pleomorphie annehmen oder verwerfen. Zu ihnen gehören u. a. Migula und Duclaux. Der erstere, ein Gegner der Pleomorphie, erkennt z. B. in bezug auf die Mikrospora comma- an, daß diese als echte typische Koramaformen vorkommen können, die ungefähr dreimal so lang als breit sind, und eine deut- liche Krümmung anzeigen ; weiter in kürzeren Längen , wobei die Krümmung stärker oder schwächer sein kann, und endlich als sehr lange Formen, sechs- bis achtmal so lang als dick, mit einer sehr starken oder kaum bemerkbaren Krümmung. Er nimmt also, wie ^) Migula, W., System der Bakterien Bd. I, p. 221. 2) 1. c, p. 234. XXII, 1. Schonten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. 35 jeder Bakteriologe beute tut, an, daß die Größe der Zellen sich verändern kann, und auch, daß Unterschiede in der Form vorhanden sein können, letzteres jedoch innerhalb gewisser Grenzen, die der Charakter der Art bestimmt. Die Grenzen zieht er mit Bestimmt- heit wenn er sagt : „Indessen so verschiedenartig auch die einzelnen Formen einer Art sein mögen, sie halten sich dennoch immer inner- halb der Grenzen, welche ihnen durch den Charakter der Gattung- gezogen sind ; niemals wird aus einer Microspora ein Spirillum oder ein Bacillus." Einen entgegengesetzten Standpunkt nimmt mit eben so viel Bestimmtheit Duclaux ein. Nachdem er verschiedene Versuche an- geführt hat, bei denen die Formen der Bakterien auf alle mögliche Weise ineinander übergehen, sagt er^: „Une Classification est im- possible k faire; il est impossible de trouver pour chaque microbe un petit nombre de proprietes assez nettes et assez constantes pour pouvoir assurer sa diagnose." Unter „Art" versteht darum Duclaux einen Bazillus von typischer Form, mit all den abweichenden Ba- zillen , die auf experimentellem Wege daraus gezüchtet werden können. Bei einem methodischen Studium der Frage von der Pleomorphie wird ja doch immer wohl eine Schwierigkeit bleiben, die man nicht ganz auflösen kann. Es ist diese: welche der veränderten Umstände, unter denen man die Form der Bakterien variieren sieht, sind abnormal, d. h. so, daß sie in der Natur nicht vorkommen, und welche sind normal. Einige Autoren ' z. B. wollen durchaus niclit leugnen , daß eine Bakterie in der Form eines Stäbchens, Vibrios und Kokkus vor- kommen kann, wenn man nur die Kultur abnormalen Umständen aussetzt. Mace" sagt über den Proteus von Hauser: „Mais pour obtenir des variations de formes , il faut placer la Bacterie dans des conditions defavorables, en particulier l'a faire vivre dans un milieu acide." Es ist wahr, daß viele Fälle von Pleomorphie, die bekannt ge- worden sind, gerade die Folge abnormaler Lebensbedingungen waren (cf. z. B. die bekannten Versuche von Guignard und Charnix mit Bac. pyocyaneus , von Schottelius mit Bac. prodigiosus etc.). In allen diesen Fällen konnten die Forscher die ursprünglichen Formen ^) Duclaux, Traite de microbiologie. I, 1898, p. 260. -) Traite pratique de Bacteriulogie. 3°ie ed. 1897. p. 329. 3* • 36 Schouten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. wieder erlangen, Avenn sie die Bakterien aueli wieder in ilirc ur- sprüug-licbe Umgebung brachten. Andere Untersuchungen — zu zahlreich um aufgezählt zu wer- den — hat man angestellt, bei denen Veränderungen erschienen unter modifizierten Umständen, die man nur in blindem Vorurteil abnormal nennen kann. In solchen Fällen nehmen die Gegner der Pleomorphie ihre Zuflucht zu einer anderen Waffe. Die Forscher sind dann bei ihrer vermeintlichen Reinkultur entweder nicht von einer Zelle ausge- gangen, oder die Kultur ist später durch Luftinfektion verunreinigt worden. Es ist nicht zu leugnen, daß beide Fälle vorkommen können. Die Möglichkeit einer Luftinfektion ist aber bekanntlich äußerst gering. Wenn man weiter mit der nötigen Vorsicht arbeitet und die Versuche, wo es darauf ankommt (wie bei den hier folgenden über Pleomorphie), nicht nur einmal ausführt, sondern gleichzeitig in verschiedenen Serien, und sie darauf noch einmal wieder- holt, dann hat mau Sicherheit, daß Luftinfektion nicht die Ursache fehlerhafter Resultate gewesen ist.' Der andere Einwand, daß man bei der Reinkultur, die man mit der Koch scheu Methode bekommen hat, nicht von einer Zelle ausgegangen ist, halte ich für bedeutungsvoller. Von verschiedenen Seiten hat man darauf gewiesen, daß der Plattenkulturmethode nicht zu trauen ist, wenn man nur einmal eine Platte ausgießt, und aus den daraus entstandenen Kolonien Kulturen anlegt, — eine üble Angewohnheit, die viele Forscher haben. Aber ich glaube nicht, daß alle Forscher Kochs Methode in dieser Weise in Anwenduna' bringen, ^'iele werden zweifellos nicht aus den zuerst entstandenen Kolonien direkt ihre Kulturen angelegt haben, sondern aus den Kolonien zuerst noch einmal eine Platte gegossen, und dies einige Male wiederholt haben, bevor sie ihre eigentlichen Versuche an- stellten. Und nun darf Pleomorphie, die man bei solchen Versuchen gefunden hat, nicht so einfach geleugnet werden. Ich für meinen Teil glaube nämlich, daß unter solchen Vorsichtsmaßregeln die Methode ^) Die Möglichkeit einer Luftinfektion haben beide Methoden. Sie ist aber bei meinem Isolationsvorfaliren mindestens ebenso gering wie bei der Plattenkulturmethode. Während meiner sechsjährigen Versuchszeit ist mir noch nicht ein Fall vorgekommen. XXII, 1. Seh outen: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. ;^ 7 von Koch nahezu vollkommene Zuverlässigkeit gil)t\ und dies ist auch die Absicht des Erfinders gewesen, dessen Methode nicht an Wert verlieren darf, weil andere sie verkehrt anwandten. Aber absolute Zuverlässigkeit k a n n sie nicht geben. .JöRGENSKN ■^ sagt darum auch: „Wenn man auch die Plattenkulturen mehrere Male wiederholt, so weiß man doch in Wirklichkeit nie, ob das Ziel erreicht ist oder nicht." Darum hat Hansen"^ Kochs Methode auf die Weise für Hefezellen verbessert, daß er auf einem großen Deckglas eine Gelatineplatte ausgießt, die so dünn ist, daß man unter dem Mikroskop kontrollieren kann, ob die Zellen geschieden sind und wo sie liegen. Die Stellen werden angedeutet, und man kann die Entwicklung der Kolonien vom ersten Augenblick an verfolgen. Für Bakterien ist dieses Prinzip natürlich undurchführbar, da man sie in einer noch so dünnen Gelatineschicht doch nicht liegen sehen und noch weniger von festen kleinen Partikelchen unterscheiden kann, die immer in kolossaler Menge darin vorkommen. Ich meine darum, daß meine Isolierungsmethode für eine ab- schließende Untersuchung über die Veränderlichkeitserscheiuungen bei Mikroorganismen' notwendig ist, und zwar vor allem, weil man hier- bei sicher ist , daß der Ausgangspunkt der Kultur eine Zelle ist, weiter, weil man die Variation schon bei den ersten Zellen der Kolonie kontrollieren kann, und nicht zum wenigsten, weil sie den Weg zu einem vergleichenden Versuch aller aufeinanderfolgenden Generationen bahnen kann (vergl. p. 13). Die Versuche, die ich gemacht habe, sind geringer, als man nach dieser langen Einleitung erwarten sollte. Der Grund hierfür ist, daß ich noch keine Gelegenheit hatte, sie weiter fortzusetzen. Was ich aber gefunden habe, halte ich für nicht zu unwesentlich, um es hier mitzuteilen. ^) Dieses gilt natürlich nur, wenn man es mit kleinen Zellen zu tun hat, auf denen sich nicht leicht andere festsetzen. Für große Zellen, die aus einem stark verunreinigten Medium kommen, die oft mit Bakterien besetzt sind, bleibt (wie ich schon in der Einleitung sagte) der Ein- wand bestehen, daß sie durch Schütteln nicht isoliert werden kimnen. selbst nicht, wenn man die Plattenkulturmethode mehrere Male an- wendet. -) Die Mikroorganismen der Gärungsindustrie. Berlin (Parey) 1898, p. 37. ^) ibid., p. 35. 38 Schonten: Reinkvilturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. I. Dr, KoHLBRUGGE^ hatte, während er an dem hiesigen hygieni- schen Institut Untersuchungen anstellte, für eine Untersuchung von Fäces Gelatineplatten angelegt und aus den Kolonien in Röhrchen mit Fleischgelatine übergeimpft. Nach einiger Zeit fand er in zwei Eöhrchen eine Mischung von Stäbchen und Vibrionen, und weil er gerade mit einer Untersuchimg über Vibrionen beschäftigt war, wollte er diese letzteren isolieren. Er goß zum zweiten Male eine Platte, diesmal von Fleischagar. Von den entstandenen Kolonien zeigte jedoch keine einzige Vibrioneu, sondern alle bestanden aus kurzen Stäbchen. Er impfte auf Glyzeringelatine, und das Resultat war wieder: nur sehr kurze Stäbchen. Nach einiger Zeit aber, als die Gelatine flüssig geworden war, untersuchte er sie wieder, und mm kamen neben den Stäbchen wieder Vibrionen vor. Aus der flüssig gewordenen Gelatine goß er mm wiederum eine Agarplatte, und die Folge war, daß er wiederum nichts als kurze Stäbchen fand. Aus derselben Gelatine goß er auch eine Gelatineplatte und machte eine Stichkultur in Fleischgelatine. Im Anfang traf er nur kurze Stäb- chen an, aber später, als die Gelatine flüssig geworden war, neben den Stäbchen auch Vibrionen. Auf keine Weise war es ihm möglich, eine Reinkultur von Vibrioneu zu gewinnen; wohl von Stäbchen, wenn er nämlich eine Kultur in Bouillon, worin beide vorkamen, bei 37^ setzte. Darin schienen die Vibrionen abzusterben, während die Stäbchen übrig blieben. KoHLBRUGGE teilte mir endlich, nachdem alle Versuche, um die Sache aufzulösen, mißglückt waren, den rätselhaften Fall mit, und ersuchte mich, doch einmal einen Vibrio aus einer flüssigen Kultur für ihn zu isolieren. Ich isolierte einige. Die Kulturtropfen bestanden aus Fleisch- gelatine. Die Deckgläschen, auf denen isoliert wurde, lagen auf feuchten Kammern, auf deren Boden ich noch ein Tröpfchen Wasser brachte. Am folgenden Morgen waren die Kolonien schon da, und wir konnten mit der stärksten Vergrößerung das Gewimmel der Vi- brionen prachtvoll sehen. Am darauffolgenden Tage hatten die Kolonien an Größe stark zugenommen ; sie nahmen ungefähr ein ^) Symbiose zweier pleomorpher Fäces -Bakterien (Arch. f. pathol. Anat. u. Phys. u. f. klin. Med. Bd. CLXIII, H. 3, p. 365). XXII, 1. Schouten: Keinkultureneiner unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. 39 Viertel von der Größe der Kulturtropfen eiu. In allen sahen wir stark bewegliche Vibrionen. Wir machten auch gefärbte Präparate davon und sahen wieder nichts als Vibrionen, Darauf wurde aus den Kolonien auf drei verschiedene Nährböden geimpft, nämlich auf gewöhnliche Fleischgelatine, auf dieselbe zehnmal verdünnt, welche also flüssig war, und auf Peptonwasser (1 Prozent Pepton). Nach zwei Tagen machten wir farbige Präparate von diesen Kulturen. In den Kulturen auf gewöhnlicher Gelatine waren lebende Vibrionen, auch Stäbchen zu sehen, von beiden ungefähr gleichviel. Die Kul- turen in flüssigen Nährböden zeigten beinahe nur Vibrionen. Auch isoliei'te ich zwei Vibrionen in Fleischgelatine, und legte das Deckgläschen auf eine feuchte Kammer, auf deren Boden ich keinen Wassertropfen brachte. Die Oberfläche der Kulturtropfen war hier also trocken. In Verbindung hiermit war auch ein Unterschied zu beobachten in der Gestalt der Bakterien aus den Kolonien. Während in den vorigen Kolonien, welche in einem mit Wasserdampf gesättigten Kaum entstanden waren, alle Bakterien nach einigen Tagen noch als stark bewegliche Vibrionen in dem Kondeusationswasser, welches auf den Kulturtropfen sich niedergeschlagen hatte, durcheinander wimmelten, entstanden hier aus der isolierten Vibrio schon im Anfang dicke Vibrionen, die unbeweglich waren (wahrscheinlich, weil sie vollständig trocken lagen), während eine Untersuchung der Kolonien, als sie drei Tage alt Avaren, neben den dicken Vibrionen schon Stäbchen sehen ließ. Es ergab sich also auf jeden Fall mit vollkommener Sicherheit aus allen diesen Untersuchungen, daß eine Vibrio Stäbchen hervor- bringen kann. Es war sehr wahrscheinlich , daß die physikalische Natur des Nährbodens hierbei eine große Rolle spielt, und zwar so, daß auf einem festen Nährboden Stäbchen, auf einem flüssigen Vibrionen entstehen. Wa r u m in flüssigen Nährböden im Anfang noch einige Stäbchen neben den Vibrionen vorkommen, wage ich nicht zu entscheiden. Aber bei Cholerakulturen ist dieses auch eine gewöhnliche Er- scheinung. Aus den Kulturen mit Vibrionen kann man wieder die Stäbchen zurückerhalten, wenn man auf feste Nährböden impft, imd aus Kul- turen mit Stäbchen erhält man die Vibrionen wieder, wenn man sie in flüssige Medien bringt. Wir haben hier also eine Erscheinung einer nicht erblichen Variation. Dieser Fall ist analog demjenigen, 40 Schonten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII. 1. dem BoxNiER bei höheren Pflanzen nachgegangen ist. Dieser For- scher^ brachte Pflanzen aus der Ebene anf die Berge, sah dort Veränderungen auftreten, brachte sie darauf wieder in die Ebene, und fand, daß sie ihre vorige Gestalt wieder annahmen. Obgleich diese Experimente wohl einigen Anspruch auf Ge- nauigkeit macheu konuten, weil ich sie nicht mit einer, sondern mit mehreren Vibrionen gemacht hatte, beschloß ich doch, derselben Frage noch einmal nachzugehen. Insonderheit wollte ich noch einmal sehen, binnen wieviel Zeit man aus einem Vibrio ein Stäbchen, und aus einem Stäbchen wieder einen Vibrio machen könne. Ich isolierte vier Vibrionen in Kulturtropfen von Fleischgelatine. Zwei davon ließ ich sich in einer feuchten Kammer, ohne Wasser auf dem Boden, entwickeln; die anderen mit einem Wassertropfen. Nach zwei Tagen kontrollierte ich die Kolonien. Die ersteren be- standen aus dicken, unbeweglichen, die letzteren aus dünneren, stark beweglichen Vibrionen. Von den Kolonien impfte ich auf Fleisch- agar, aus jeder Kolonie in ein Röhrchen. Nach zwei Tagen schien es bei Untersuchung der lebenden Zellen, wie der gefärbten Prä- parate , daß in allen Röhrchen nichts als sehr kleine bewegliche Stäbchen , höchstens 1 /tt lang , vorkamen , einige so kurz , daß es beinahe Kokken waren. Aus jedem dieser Agarröhrchen impfte ich in Bouillon, gewöhnliche und zehnmal verdünnte Bouillongelatine. Nach zwei Tagen schienen alle flüssigen Nährböden nichts als große, stark bewegliche und stark gekrümmte Vibrionen zu enthalten, wäh- rend auf der Fleischgelatine nur kleine, bewegliche Stäbchen vor- kamen. Innerhalb 6 Tagen war also der Übergang vom Vibrio zum Stäbchen, und vom Stäbchen Avieder zurück zum Vibrio ab- gelaufen. Noch ein kurzes Wort will ich beifügen nacli Anleitung einer Bemerkung, die Kohlbrugge in der oben genannten Abhandlung (pag. 375) macht. Er sagt darin, daß das Stäbchen aus dem Gemenge von Vi- brionen und Stäbchen, das icli auch für ihn isolierte, nach der Iso- lierimg die Gelatine nicht mehr verflüssigte, aber vorher wohl. Das war vollkommen richtig. Der Grund für diese Erscheinung war, daß ich bei meinen ersten Experimenten die Nadeln beim Sterilisieren zuweilen tiefer in die Schwefelsäure als ins Ammoniak eintauchte. Da- ^) Recherches sur Tanatomie experimentale des vegetaux. G. Bonnier. Ed. Crete. Corbeil (S. et 0.) 189G. XXII, 1. Scliouten: Reinkultureneinerunterd. Mikroskop isoliert. Zelle. 41 diircli diffundierte, worauf ich oben (p. 21) schon verwiesen habe, die überflüssige Säure nach der Spitze der Nadel, zum Nachteile natürlich der isolierten Bakterien. Als ich unter Vermeidung' dieses Fehlers das Stäbchen nochmals isolierte, schien sein Verflüssigungsvermögen nach der Isolierung ebenso stark zu sein. II. Bei einer Untersuchung über „Raggi", die ich in „'s Lands Plantentuin" zu Buitenzorg machte , wurde ich schon im Anfang durch eine Erscheinung, die meine Aufmerksamkeit erregte, auf einen Seitenweg geführt, den betreten zu haben ich mich aber nicht zu beklagen brauche. Ich nahm nämlich wahr , daß die Sporangien von Rhizopus Oryzae, einem der beiden Pilze, die stets im Raggi gefunden werden, Sporen enthalten von sehr verschiedener Größe und Gestalt. Die kleinen waren meistens elliptisch, + 6x5/* groß ; daneben waren langgedehnte Sporen darunter, z. B. von .32 X 8 /^ und dazwischen allerlei Übergänge. Unter dem Eindruck der Untersuchungen von DE Vries über Mutation, fragte ich mich unwillkürlich, ob die ver- schiedenen Sporen unter denselben Bedingungen ausgesäet , immer einen Pilz von derselben Form geben würden. Bei meinen Experimenten ging ich immer von eine m Sporan- gium aus , aus dem ich dann nach meiner Reinkulturmethode drei Sporen, eine kleme, eine mittelgroße und eine große aussuchte, und diese in Tropfen von derselben Nährflüssigkeit brachte (5 Prozent Glukose, ^/.i Prozent Pepton, ^/^^ Prozent Mouokaliumphosphat, Yoo ^^^' zent Magnesiumsulfat). Dies alles geschah unter einem Deckgläs- chen, so daß die Bedingungen für alle drei dieselben waren. Als das Mycelium sich in einem Tropfen genügend entwickelt hatte, wurde es in ein Röhrchen mit Glukose-Pepton-Agar (obengenannte Mischung -j- 2 Prozent Agar) gebracht. Auch hierbei sorgte ich für voll- ständige Gleichheit des Nährbodens. Zunächst schien es mir, daß die Entwicklung während der ersten 24 Stunden in gleichem Verhältnis zu der Größe der Spore war ; später fiel der Unterschied weg oder war doch nicht mehr wahr- nehmbar. Die mittelgroßen und die großen Sporen gaben stets den normalen Pilz. Die kleinen entwickelten sich in den ersten 3 Tagen nur bis zu einem gewissen Stadium (zu einem so kleinen Mycelium, 42 Schonten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1, daß es noch bequem in dem Tröpfchen , in dem die Spore isoliert war , Platz hatte) , blieben darauf einige Tage stehen und gingen dann in den meisten Fällen zugrunde. Doch waren auch solche darunter, die das kritische Stadium überwanden und dann sofort eine Zwergrasse gaben , die sich als erblich konstant erwies ; sah ich doch während der vielen Impfungen^ die ich gut 3 Jahre lang anstellte , keine Veränderungen. Wir haben hier also einen Fall von Mutation bei Pilzen. Wenn man den normalen Pilz und die Zwergrasse (beide also von einem Sporangium herrührend) nebeneinander setzt, sieht mau makroskopisch folgende Unterschiede : Normal: Füllt nach 2 Tagen die untere Hälfte des Röhrchens ganz mit seinen langen Öporangienträgern , auf denen die ziemlich großen Sporangien sitzen. Z w e r g r a s s e : Bildet nur eine filzartige Schicht auf der Ober- Hache des Nährbodens ; diese Schicht wird einige Millimeter dick ; die Sporangienträger werden höchstens 4 mm lang. Mikroskopisch findet man folgende Einzelheiten : Normal: Diameter der Sporangien + 180 ,a, Dicke der Sporangienträger + 16 /i. Die Sporen ungefähr 8x6 /t. Zwergrasse: Diameter der Sporangien + 70 /^, Dicke der Sporangienträger + 8 f-i. Mittlere Größe der Sporen 6x4 /t. Sehr dünne Sporangiumwand , was auch daraus deutlich wird , daß man mit einer Impfnadel niemals ganze Sporangien überimpfen kann, da sie beim Berühren sofort zertrümmert Averden. Das ist bei der normalen Form absolut nicht der Fall. p]s ist mir noch nicht klar, welche Faktoren das Absterben des Myceliums von einer kleinen Spore bewirken, und welche Fak- toren es dieses Stadium überleben lassen, um dann eine Zwergrasse zu formen. Zusammenfassung. 1) Die neue Methode zur Herstellung von Reinkulturen läßt sich kurz hierin zusammenfassen : Unter dem Mikroskop wird, wenn nötig bei stärkster Vergrößerung , mit Hilfe von feineu Glasösen, eine Zelle aus einem Tropfen mit verschiedenen Mikroorganismen isoliert und in einen sterilen Tropfen gebracht, worin sie sich zu einer Reinkultur entwickelt. XXII, 1. Schonten: Reinkultureneiner unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. 43 2) Der Nachteil dieser Methode (wenn ich das einen Nachteil nennen darf) besteht hierin , daß sie an die , welche sie anwenden, höhere Forderungen stellt als die von Koch. Ich vermute darum, daß ganz unpraktische Menschen sie nicht immer mit Befriedigung anwenden werden. Auch fordert sie wohl mehr Zeitaufwand. 3) Der allgemeine Vorteil besteht darin, daß man mit ihr Mikro- organismen sozusagen individuell beliandeln kann. Wenn mau sie bei Reinkulturen anwendet, hat man vollkommene Sicherheit, daß die einzelne Kultur aus nicht mehr als einer Zelle entstanden ist. Weiter kann man die Zelle, die man isolieren will, auswählen, ^ und nach der Isolierung genau kontrollieren , was mit der Zelle vor- gegangen ist. Die Entwicklung der Reinkultur kann man dann auch vom ersten Augenblick an mit starker Vergrößerung beobachten, besonders wenn der Nährboden fest ist. Dieses sind Vorteile , welche die Plattenkulturmethode nicht darbietet , da sie niemals vollkommen Sicherheit zu geben ver- mag, daß alle Kolonien aus einer Zelle entstanden sind ; da ferner beim Gießen einer Platte stets uns unbekannt bleibt, welche Zellen sterben, welche sich weiter entwickeln, und was anfänglich mit diesen letzteren passiert, - und endlich , weil man bei einer Plattenkultur niemals die EntAvicklung der Kolonien mit der stärksten Vergrößerung kontrollieren kann. 4) Diese Methode kann für eine endgültige Untersuchung aller möglichen Fragen, die Pleomorphie betreffen, dienen. Man geht hier nämlich von einer Zelle aus und kann sofort sehen, welche die Form der Zellen ist , ' die daraus entstehen. Ich zweifle nicht , daß man auch alle aufeinander folgenden Generationen wird untersuchen können. Gilt das Gesagte speziell für die Herstellung von Reinkulturen, so sind doch auch noch andere Anwendungen luöglich. Man wird mit Hilfe dieser Methode allerlei Mikroorganismen miteinander in Berührung bringen oder verschiedenen Experimenten unterwerfen können. Man wird also z. B. : ^) Das ist besonders von Bedeutung, wenn man mit einem Ma- terial zu tun hat, bei dem ein großer Teil der Zellen mit Bakterien besetzt ist. ^) Es können denn auch beim Gießen von Plattenkulturen oft sehr rätselhafte Fälle sich einstellen, in denen die Koch sehe Methode, auch bei wiederholter Anwendung uns im Stiche läßt (cf. oben die Vibrionen von Kohlbrugge). 44 Schüuten: Reinkulturen einer unter d. Mikroskop isoliert. Zelle. XXII, 1. 5) die Frage der Kopulation mit ihr untersuchen können. Es gibt im Tier- wie im Pflanzenreich viele Fälle, wo man nicht weiß, ob man es mit Kopulation zu tun hat. Das ist natürlich kaum aus- zumachen, wenn solche Zellen, die oft beweglich sind, sich in großen Tropfen zugleich mit anderen Organismen befinden. Jetzt ist man imstande auf einem Deckglas in verschiedenen kleinen Tropfen zwei Zellen zusammen zu bringen ; man kann also viel bequemer vmter- suchen, ob Kopulation stattfindet. Konnte man dieses früher nur zufälHg sehen, so hat man jetzt eine sichere Methode. 6) ^an wird vielleicht unter dem Mikroskop verschiedene Ex- perimente über Symbiose und Parasitismus niederer Organismen machen und diese von Anfang an kontrollieren können. 7) Schließlich will ich noch darauf weisen, daß für rein tech- nische Zwecke der Isolierungsapparat nützlich sein kann. Das Sortieren von sehr feinem Planktonmaterial und die Anfertigung von Dauerpräparaten davon (besonders einzelner Orgaue), wird bequemer und mit größerer Exaktheit vorgenommen werden können als unter der Lupe oder dem Präpariermikroskop aus freier Hand. Die Unter- suchung oder das Zeichnen lebender Mikroorganismen, die stark be- weglich sind (z. B. Infusorien, Schwärmsporen), ist oft nicht möglich, da sie fortwährend aus dem Gesichtsfelde des Mikroskops ver- schwinden. Mit Hilfe des Isolierungsapparates kann man sie aber in ein kleines Tröpfchen überführen, wenn nötig so klein, daß sie genau hineinpassen und sich also nicht drehen können. 8) Um den Wert der Methode zu bestimmen, speziell was die Anfertigung von Reinkulturen betrifft, sind mit ihr Reinkulturen von einer großen Anzahl Mikroorganismen (Bakterien , Hefe- und Pilz- arten) angefertigt , auch von solchen , bei denen die Züchtung bisher nach der Platteukulturmethode mehr oder weniger Nach- teile hatte. 9) Die Methode ist angewendet für die Untersuchung der Frage nach der Pleomorphie ; mit vollkommener Sicherheit ist bewiesen, daß ein Vibrio sich in ein Stäbchen und ein Stäbchen sich in ein Vibrio verändern kann. 10) Der Bacillus , der zu diesen Experimenten diente , zeigte die Form eines großen Vibrios auf einem gewöhnlichen , flüssigen Nährboden und die Form eines kurzen Stäbchens auf demselben Nährboden, wenn dieser mit Gelatine festgemacht war. 11) Der Übergang vom Vibrio zum Stäbchen und vom Stäbchen wieder zum Vibrio kann in G Tagen sich vollziehen. XXII, 1. Hansen: Über HJimateinKjsungen und Cochenillefarblösungen. 45 12) Mit Hilfe dieser Methode ist es geglückt, durch Mutation eine Zwergrasse aus einem Pilz (Rhizopiis Oryzae) entstehen zu lassen. Während der vielen Impfungen, jetzt 3 Jahre lang ausgeführt, er- wies sich diese Zwergrasse als konstant. Am Ende dieser Arbeit ist es mir eine angenehme Pflicht, Herrn Prof. F. A. F. C. Went, Direktor des botanischen Instituts, und Herrn Prof. C. Eykman , Direktor des hygienischen Instituts, meinen herzlichen Dank auszusprechen für das freundliche Interesse, das sie meiner Arbeit entgegengebracht haben. [Eingegangen am 16. Februar 1905.] Über Eisenbämatein, Chromalaunhämatem, Tonerdealaunhämatem, Hämateinlösungen und einige Cochenillefarblösungen. Von F. C. C. Hausen, am Normalanatomischen Institut der Universität Kopenhagen. I. Die Eisenhämateine. In seiner großen Arbeit : „Neue Untersuchungen über Zentral- körper" ( Arch. f. mikr. Anat. Bd. XLIII, 1894), sagt Martin Heidek- HAiN bei Besprechung seiner Eisenhämatosylinmethode folgendes : „Natürlich habe ich auch versucht in Analogie des Böhmer sehen Prinzipes (Hämatoxylin-Aluminium-Farben) das Eiseuhämatoxylin in Lösung zu erhalten, die Farbe somit, wie Benda sich trefl'end aus- drückt, als ^Tinte' zu verwerten, allein hierbei erhielt ich nur minder- wertige Tiuktiouen." Später hat Fr. A. Janssens und A. Leblanc (Zeitschr. f. wiss. Mikrosk. Bd. XV, p. 264) den Ammoniakalaun in Delafields Ge- misch durch Eiseualaun ersetzt und zur Färbung der Kerne der 46 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. Hefezellen benutzt ; jüngst hat Karl Weigert (Zeitsclir. f. wiss. Mikrosk. Bd. XXI, 1904, p. 1 — 5) ein Eisenhämatoxylin angegeben, nämlich: A) 1 g Hämatoxylin in 100 cc 96prozentigem Alkohol ge- löst. B) 4 cc Liqu. ferri sesquichlorati (Ph. G. IV. enthält ca. 10 Proz. Eisenchlorid) -|- 1 cc offizin. Salzsäure (enthält ca. 25 Proz. HCl) und 95 cc Aqu. destill. Von A und B werden gleiche Teile gemischt, man erhält keine Fällungen, sondern eine schwarze Lösung, welche wiederholt benutzt werden kann, aber am besten jedesmal frisch bereitet wird (Färbe- dauer wenige Minuten). Die Färbung wird als Keruvorfärbung für „VAN Gieson"- Färbung benutzt. Selbst hatte ich auch seit 1899 vielfach eine schnelle Eisen- hämatoxylinmethode benutzt , die im wesentlichen eine modifizierte BENDASche war: Kurze Beizung der Schnitte mit Eisenchloridlösung (4 Prozent) — aber in der Wärme, und hernach Behandlung, ebenfalls in der Wärme, mit stark oxydierter, ^ wässerig alkoholischer Hämatein- lösung, Diflterenzierung in der Eisenchloridlösung. Es war also etwas ähnliches, wie das von Gurwitsch angegebene Schnellverfahren. Verschiedene Umstände veranlaßten mich im vorigen Jahre ein- mal wieder mit Hämatoxylin- und Hämateinfarben mich genauer zu beschäftigen, und die für jeden Mikrotechniker naheliegende Idee, über welche sich Martin Heidenhain (wie ich später fand) loc. cit. 1894 so unzweideutig geäußert hat, versuchte ich weiter auszuarbeiten. Meine Resultate sind so befriedigend gewesen , daß ich glaube , die nachstehenden Farblösungen für den weiteren Gebrauch empfehlen zu können ; wir haben dieselben hier im Institute vielfach benutzt. Daß sie die altbewährten Eisenhämatoxylinmethoden von Benda und Heidenhain überall ersetzen sollen, ist nicht von mir beabsichtigt. Durch die grundlegenden Untersuchungen Otto Linne Erdmann s^ im Jahre 1842 über das Hämatoxylin, wurde definitiv gezeigt, daß die eigentlich färbenden Eigenschaften nicht dem Hämatoxylin, son- dern dem von Erdmann zuerst chemisch rein dargestellten und genau untersuchten Hämatein zukommen; das Hämatoxylin färbt nur, ^) Mit der berechneten Menge Kaliumpermanganat nach meiner Me- thode; siehe später. -) Erdmann, 0. L. , Über das Hämatoxylin (Journ. f. prakt. Chemie Bd. XXVI, 1842, p. 193—216). XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblüsungcn. 47 wenn es durch Oxydation in Hämatei'n, resp. Häraateinverbindungen oder in noch höhere Oxydationsstufen überführt wird. — Durch die Arbeiten von Gerhardt, Erdmann und Hesse wurde die Elementar- formel des Hämatoxylins genau bestimmt, sie ist bekanntlich : C-^^H^^Og und kristallisiert mit 1 H^O (rhombisch) oder mit 3 H.,0 (tetragonal). Letztere Verbindung dürfte infolge der Darstellungsmethode des Hämatoxylins die gewöhnlich im Handel vorkommende sein. Alle Angaben im folgenden beziehen sich daher auf das mit ,3 H.^O kristallisierende Hämatoxylin. Das Molekulargewicht desselben ist: 302 -f 54 = 356. Das Hä matein entsteht aus dem Hämatoxylin, indem zunächst 2 Atome Wasserstoff wegoxydiert werden , dagegen tritt , wie Erd- mann -^ zuerst meinte, kein Sauerstoff in das Molekül ein. Die Reak- tion ist also : Cto^^o + = c^r^e + H,0. Hämatoxylin Hämatein D a s M 1 e k n 1 a r g e w i c h t d e s H ä m a t e 1 n s ist also 300. Die für analytische Zwecke angegebene Darstellungsweise des Hämateins wurde ursprünglich von 0. L. Erdmann 1842 genau angegeben und ist mit geringen Modifikationen- die noch gebräuchlichste (sie steht beschrieben loc. cit. 1842, p. 205 — 207). Hämatoxylin wird in nicht zu kleiner Quantität in heißem Wasser, worin es leicht löslich ist, gelöst, ein kleiner Überschuß von Ammoniak wird zugesetzt, -die also alkalische purpurne Lösung in eine flache Schale gegossen und lose zugedeckt der Oxjalation des Luftsauer- stoffs überlassen. Ammoniak muß immer im Überschuß zugegen sein, und die Oxydation muß bei immer vorhandenem Überschuß von Hämatoxylin verlaufen, sonst erhält man leicht höhere Oxydations- produkte als Hämatein."^ Ich kann Erdmann nicht in extenso zitieren, aber jeder mit Hämatoxylin arbeitende Mikrotechniker sollte diese 1) loc. cit. 1842. -) Siehe auch meinen Artikel: Über Oxydationsmittel für Hämatoxylin ; vgl. 0. L. Erdmann, loc. cit., Hesse, loc. cit. (p. 338) 1859, E. Erdmann, Schultz, loc. cit. 1883, p. 23G u. a. ^) Die Unkenntnis mit diesen und andern schon 1842 von Erdmann angegebenen Verhältnissen hat sicherlich die Mißerfolge vieler Mikrotech- niker mit dem (ähnlichen) Paul Mayer schem Eezepte (1891) zur Dar- stellung des Hämatemammoniaks verursacht. 48 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. und die andern Originalarbeiten lesen, „überflüssige Entdeckungen" würde es dann weniger geben. Nun läßt sich natürlich die Oxydation des Häraatoxylins in das färbende Hämatein auch durch viele andere Oxydationsmittel vor- nehmen, und viele chemische Stoffe, welche leicht Sauerstoff abgeben, sind dazu geeignet.-^ Auch in der Mikrotechnik des Hämatoxylins tut man gut daran, quantitativ zu verfahren, Avie ich- es 1895 angegeben habe. Die Bedingung ist nur die , daß man die Reaktions- gleichung für die Einwirkung des S a u e r s t o f f s p e n d e r s auf das H ä m a t o x y 1 i n kennt. Wünscht mau die zur Über- führung in Hämatein (oder noch höhere Oxydationsprodukte) pro 1 g Hämatoxylin (tetragonal) nötige Menge eines be- liebigen Sauer Stoff sp end er s zu kennen, so läßt sich diese Größe dann aus den chemischen Formeln leicht berechnen. Ein Molekül Hämatoxylin braucht zur Überführung in Hämatein 1 Atom Sauerstoff; setzt man das Grammolekül Hämatoxylin als 356, und ist n die Anzahl Sauerstoffatome , welche ein Grammol (GM.) des Sauerstoffspenders zur Oxydation des Hämatoxylins in Hämatein der Reaktionsgleichung gemäß abzugeben vermag , so gibt folgende Gleichung die pro 1 g Hämatoxylin nötige Menge eines beliebigen Sauerstoffspenders mit einer für unsere Zwecke allgemein genügenden Genauigkeit : _ 0-0028 • GM. n 1 g Hämatoxylin braucht zur Überführung in Hämatein folgende Mengen der unten beispielsweise aufgezählten Stoffe : von Kaliump ermanganat 0'177 g Kaliumbichrouiat 0'276 ., n Kaliumchlorat'^ 0114 )) ^) Siehe meinen Artikel über Oxydationsmittel für Hämatoxylin. -) Eine schnelle Methode zur Darstellimg des Böhmer sehen (Alaun-) Hämatoxylins (Zool. Anz. No. 375, Febr. 1895). ^) Bei der Anwendung von Chloraten und Perchloraten muß die Reaktion in saurer Lösung geschehen, und es muß als Sauerstoff Über- führer eine ganz geringe Menge von Kupfer-, Chrom-, Eisen- oder, wie ich iramer anwende, 1 bis 2 mg Vanadinsalz zugegen sein; die Demon- strationsversuche ohne Säure und mit Säure, ohne „Transferrer" und mit Transferrer sind sehr instruktiv (s. meinen Artikel „Über Oxydations- mittel" etc.). XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 49 von K a 1 i u m p e r c h 1 r a t 0*097 g „ Kaliumjodat 0*200 „ „ Kaliumbij odat 0-182 „ „ Na tri umj odat (Paul Mayer 1904). . 0*187 „ etc. Bei Erdmann (1842) steht u. a. p. 205: „Eisenalaun^ erzeugt (mit Hämatoxylin) erst nach einiger Zeit einen geringen schwarz- violetten Niederschlag." p. 212 steht: „Das Hämatein- Ammoniak gibt mit den meisten Metallsalzen gefärbte Niederschläge. Mit essig- saurem Bleioxyd einen dunkelblauen Niederschlag, mit schwefel- saurem Kupferoxd bildet sich ein blauer ins violette geneigter Niederschlag. Mit salpetersaurem Wismutoxyd prachtvoll vio- letter Niederschlag. Mit Eisenalaun schwarzer Niederschlag. Mit Eisenchlorür [!] violetter Niederschlag." Ähnliche Angaben finden sich in allen Chemien die Farbstoffe betreffend. In der praktischen Färberei werden diese Eigenschaften be- kanntlich schon lange ausgenützt. Was speziell die Eisenhämatoxylinfärbung betrifft , haben wir es bekanntlich"'^ mit folgenden Verhältnissen zu tun. Die Eisenbeize muß am besten eine Eisenoxydverbindung sein. Verwendet man z. B. den Eisenalaun, so geschieht folgendes : 1) Es fixieren sich auf dem mikroskopischen Schnitt (oder den Geweben) basische unlösliche oder schwerlösliche Eisenoxydver- bindungen, z. B. basische Salze. 2) Dieselben bilden mit verschiedenen Farbstoffen schwer-, resp. unlösliche gefärbte Verbindungen — Lacke. Wird z. B. Häma- toxylin verwendet, ist die Wirkung eine doppelte; einerseits wird das Hämatoxylin in Hämatein (oder in noch höhere Oxydations- stufen, darüber später) von einem Teil des Eisenoxydsalzes über- führt,^ wobei sich Eisenoxydulverbindung bildet. ^) Dies trifft, wie meine Angaben unten zeigen, nicht ohne weiteres zu ; man muß dann nämlicli eine nicht zu konzentrierte Hiimatoxylinlösung, welche einige Zeit (wohl verschlossen) gestanden hat, nehmen, ferner muß diese Lösung, sowie die Eisenalaunlösung kalt und letztere Lösung nicht zu verdünnt sein, sonst geschieht die Oxydation in Hämatein und „Ferro- lackbildung", wie ich angeführt habe. ') Den Chemikern vom Fach ist dies lange bekannt und von ihnen habe ich es meinerseits wieder gelernt. «) Vgl. P. Mayer im Anat. Anz. Bd. XIII, 1899, p. 319 (die Note!). Dieser, um die Mikrotechnik so verdiente Forscher, hat diejenigen Mikro- Zeitschr. f. wiss. Mikroskopie. XXII, 1. 4 50 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. Anderseits verbindet sich der Rest des basischen Eisen- salzes oder Oxydes mit dem gebildeten Hämatein; die färberischen Eigenschaften dieses Eisenlackes haben Benda und M. Heidenhain mit so großem Erfolge in der Mikrotechnik verwertet. — Wird Hä mateinlösung gebraucht, könnte jedenfalls die oxydierende Wirkung des Eisenoxyds wegfallen (gewöhnlich tut sie es aber nicht, darüber später ; vgl. auch P. Mayer, loc. cit.), und könnte man statt der Eisenoxydverbindung auch Eisenoxydulverbindungen als Beizen verwenden, was ich auch tatsächlich mit Erfolg getan habe. Man kann also zweifach verfahren : Entweder getrennt beizen und färben oder beides gleichzeitig tun(BENDA, Heidenhain, Weigert). Beizende Eigenschaften kommen im hohen Grade solchen Stotfen zu, welche teils leicht basische Salze , teils oder zugleich Verbindungen von mehreren Oxydationsstufen bilden (auf andere Beizen gehe ich hier natürlich nicht ein). Daher die allgemein übliche Verwendung von Aluminium-, Eisen-, Chrom- (und Kupfer-) Verbindungen, welche uns in der Mikrotechnik überwiegend interessieren. Betrachten wir zunächst die E i s e n v e r b i n d u n g e u. Gewöhn- lich verwendet man den Eis enalaun-F erriamm oniumsulfat VI Fe^CSOJg, (NHJ2 SO, + 24H2O. Mol. = 965. Löst man diesen Stoff in (ausgekochtem) Wasser, so wird, was wichtig ist, eine teilweise Hydrolyse des Eisenoxydsulfates eintreten , die Lösung färbt sich gelb , gelbbraun und enthält außer unzersetztem Eisenoxydsulfat ^ freie Schwefelsäure und kolloidal ge- löstes Ferrihydroxyd, Mit steigender Temperatur wird die Hydro- lyse stärker und daher auch die Braunfärbung der Lösung; eben diese hydrolytische Spaltung ist für die beizenden Eigenschaften der Lösung wichtig , ebenso erhellt sich hieraus das Faktum , daß die Beizung- in der Wärme schneller geht. Es lassen sich diese Ver- hältnisse durch Versuche leicht demonstrieren; die gebildete freie techniker, welche dieses Verhalten des Hämatoxylins vorher nicht kannten, darauf aufmerksam gemacht und auch hierhergehörige Experimente an- gegeben. V) Von der Ionisation sehe ich hier ab. '^) Die Ablagerung von basischen Verbindungen in dem Gewebe — also auch die Färbung. XXII, 1 . Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen, ö 1 Säure (auch z. B. aus einer Eisenchloridlösung) kann man beispiels- weise teilweise wegdittundieren lassen , wodurch der Gehalt der Eisenbeizlösung an kolloidalem Ferrihydroxyd zunimmt. Eine solche Eiseulösung beizt auch in der Kälte weit schneller und stärker als eine gewöhnliche Lösung des Eisensalzes. Eine größere Verdünnung der Eisensalzlösung vermehrt die Hydrolyse , begünstigt somit die Ablagerung von Eisenoxyd , resp. von basischen Salzen in den Geweben, aber zugleich setzen auch solche Salze sich im Gefäß nach einiger Zeit ab. Der Konzentrations- abnahme entsprechend wird aber von einer gewissen Grenze ab die Beizung absolut schwächer. Daß die Abspülung der gebeizten Schnitte in Brunnenwasser (alkalisch, kohlensäurehaltig !) ebenfalls die Bildung von Eisenhydroxyd, resp. basischen Salzen begünstigt, ist ohne weiteres klar. Umgekehrt verringert ein Zusatz von freier Säure zur Eisen- salzlösung deren Beizwirkung entsprechend der Massenwirkung. Soll daher die Eisenalaunlösung beim Stehen keine unlösliche basische Ver- bindungen in der Flasche absetzen, so nehme man eine etwas stärkere Lösung als l-^/^ Prozent, z. B. 5 Prozent, in der die Hydrolyse relativ geringer ist. Auch kann man der Lösung eine entsprechende Menge Schwefelsäure zusetzen , dadurch wird die Hydrolyse ebenfalls ver- mindert ; bei größerem Überschuß an freier Säure wird die Hydrolyse ganz aufgehoben erscheinen , statt der braunen , braungelben Farbe, hat man eine ganz schwach gelblich gefärbte oder ungefärbte Flüssig- keit. Was die 'oxydierende Wirkung der Ferrisalze (Ferri- sulfat , Eisenalaun , Eiseuchlorid etc.) betrifft , so verläuft die Reaktion in den einfachen Fällen (in saurer Lösung) folgendermaßen : VI II Fe, (SOJ. + HoO = 2 Fe SO^ + H, SO^ + Ferrisulfat Ferrosulfat also 1 g Mol. Ferrisalz vermag 1 g Mol. Hämatoxylin in H ä m a t e 1 n zu überführen. Nimmt man Eisenalaun, Ferriammoniumsulfat, so braucht man davon 2*7.1 g um 1 g Hämatoxylin in Hämatein zu oxydieren, unter der Voraussetzung , daß die Reaktion quantitativ verläuft, und dies dürfen wir der Hauptsache nach annehmen. Die Reaktionsgleichung ist: 4* 52 Hansen: Über Hämateinlösung'en und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. VI II I : Fe, (SO J. ; (NH J^ >S0^ + H,0 =- Fe SO^ ; (NHJ, SO, Ferriammoniuiüsulfat Ferroammoniumsulfat II + Fe SO^ + H, SO, + Ol und II: C,,H,,0, + 0, = C,,H,,0, + H,0. Hämatoxylin Hämatein F;S tritt also Ferroammoniumsulfat (Mohrs Salz), Ferrosulfat^ und freie Schwefelsäure auf, wenn in einer Eisenalaunlösung Häma- toxylin zu Hämatein oxydiert wird, und es läßt sieb leicht zeigen, daß Hämatein sowohl mit dem Ferrosulfat als auch mit dem Ferroammoniumsulfat" dunkelviolette bis schwarzviolette Verbindungen eingeht. (Conf, Erdmann 1842'^ und später.) Und dasselbe tritt natürlich ein mit dem bei der Oxydationsreaktion entstandeneu Ferrosalze, wie der Versuch leicht zeigt. Eine der „blauen" Methode Martin Heidenhains ganz ähn- liche Färbung läßt sich mit „Ferrohämatein" folgendermaßen aus- führen. 1*355 g Eisenalaun wird kalt in 50 g (sauerstoff freiem und kohlensäurefreiem) ausgekochtem Wasser gelöst; 0*50g Hämatoxylin wird ebenso in 50 g ausgekochtem heißem Wasser gelöst und her- nach abgekühlt, wobei das Hämatoxylin bekanntlich nicht wieder aus- fällt. Die angegebene Menge Eisenalaun reicht gerade hin, um alles Hämatoxylin in Hämatein zu überführen. Dies beginnt gewöhnlich auch in der Kälte, sobald man die eine Lösung in die andere gießt; am besten werde die Eisenlösung langsam unter stetem Umrühren in die Hämatoxylinlösung gegossen. Die Hämatoxylinlösung wird bei Erwärmung sehr schnell in Hämatein überführt, höhere Oxydations- stufen kommen zunächst nicht vor, weil einerseits niemals Überschuß an Sauerstoff vorhanden ist, und auch die gebildeten Ferrosulfate eine andersweitige Oxydation vorläufig verhindern. Man erhält eine dunkelviolette Lösung, welche reichlich schwarze Ausfällung enthält. Diese Lösung enthält die Verbindung von Häma- ^) P. Mayer hat 1899 das Auftreten, von Ferrosulfat besprochen (siehe loc. cit.). ^) Durch vorheriges Hinzufügen der berechneten Menge Ammonium- sulfat läßt sich das gebildete Ferrosulfat in der Form des stabileren Ferro- ammoniumsulfats erhalten. 3) loc. cit. p. 219. XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 53 tein lind Ferrosalz (Hämatoxylin und Ferrosalz verhält sich ganz an- anders, ist nicht gefärbt). Die Lösung, welche, um die Luftoxydation möglichst zu vermeiden, nicht filtriert wird, färbt beim Versuch so- gleich sehr schnell die Schnitte mit schwarzvioletten oder fast ganz schwarzen Kernen, Plasma mehr violett, glatte Muskeln und Binde- gewebe ebenso; Kittleisten, Centrosomen lassen sich bei passender Anwendung auch färben. Die Färbung ist gegen starke Essigsäure sehr resistent. Um seiner Sache ganz sicher zu sein, mag man mit Ferrosulfat (konz. Lösung) nachbehandeln (eventuell mit einer Spur von Oxalsäurezusatz). Auch kann man die Farblösung mit einer reinen Lösung von Ferroammoniumsulfat vermischen (dieselbe löst nicht unbedeutend die schwarzviolette Lackverbindung) imd hernach färben (Schnitte vorher mit sauerstoflffreiem Wasser behandelt). Es kann kaum ein Zweifel darüber bestehen, daß wir hier die Erd- mann sehe F e r r h ä m a t e i n V e r b i n d u n g auf die Gewebe fixiert haben. ^ Natürlich läßt sich auch Eisensulfat (Ferrosulfat) verwenden, wobei man der Lösung eine Spur von Oxalsäure zusetzt, um sicher alles Eisenoxydsulfat zu reduzieren;^ und zur Abwechslung kann man also die von mir unten angegebene^ (frisch bereitete) Hämatei'n- lösung verwenden. Die Resultate sind auch auf diese Weise ganz ähnlich, nur werden die Töne mehr schwarzgrau.* Ferrohämatein löst sich in nicht unbedeutender Menge in Eisensulfatlösung, freie Schwefelsäure begünstigt die Lösung, Auch in Ferroammoniumsulfat kann man die Hämatein- lösung oder die Hämatoxylinlösung in diese Oxydulsalzlösung gießen und nachträglich mit der berechneten Menge Sauerstolfspender (Kalium- permanganat, F erria mm oniumsulf a t) oxydieren. Die Resultate sind ähnlich. Verwendet man statt Hämateinlösung d i e fnach meiner Angabe unten) 2 bis .3 f a c h x y d i e r t e ,. a 1 s die Oxy h ä m at eine , so werden die Färbtöne viel schwärzer, resp. ganz: schwarz, auch mit Eisenoxydulsalzen. Es läßt sich zeigen, daß ^) Doch mögen bei der „blauen" Farbe Heidenhains die Kalksalze des Leitungswassers etwas mitwirkend sein. Bei dem kürzeren Beizen bei der Heidenhain sehen blauen Methode fixiert sich weniger Ferrioxyd auf das Gewebe, so daß die disponible Sauerstoffmenge nur zur Bildung von Hämatein, jedenfalls nicht zur Bildung von so großen Mengen der höiieren Uxydationsprodukte hinreicht, daß die Färbung schwarz würde. -) Rhodankaliumprobe. ^) Mit Kaliumpermanganat quantitativ oxydiert. ^) Ob sieh wohl mehr Eisensalz an das HämateVnmolekül anlagert? 54 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. eine Oxydation der Eisenoxydulverbindungen seitens der Hämateine und Oxyhämateine gewöhnlich nicht vorkommt; darüber später. Wichtig für die Färbung mit Eisenhämatein und besonders für die Elektion ist natürlich die aus den Ferriverbiudungen abgespaltete Schwefelsäure. Ist dagegen Überschuß an Eisenoxydverbindungeu vorhanden, so ist teils Sauerstoff zur höheren Oxydation des Hämateins disponibel, teils treten die Eisenoxydlacke auf. Die genaue Untersuchung dieser Verhältnisse muß natürlich quantitativ vorgehen und läßt sich auch nicht allzuschwer ausführen. Die Bedeutung der Oxydationsstufe des Hämateins habe ich untersucht, dagegen nicht, wie viele Eisenatome mit dem Hämatein- molekül verbunden sind, dazu fehlten mir die Gelegenheit und die Mittel. Als ich zur Ausprüfung einer Eisenhämateinlösung ging, ent- schied ich mich nach vielen Versuchen für das von M. Heidenhaix gebrauchte Ferriammoniumsulfat, welches entschieden mehrere Vorzüge den übrigen, auch leichtzqgänglichen Eisenoxydsalzen gegen- über besitzt. Ferner waren mehrere Punkte zu berücksichtigen. Es mußte genügend Eisen oxydsalz vorhanden sein, wenigstens genug, um das H ä m a t o x y 1 i n in H ä m a t e i n zu überführen. Die dazu erforderliche Menge beträgt per 1 g Hämatoxylin 2*71 g Ferriammoniumsulfat.^ Der Eisenhämateinlack ist bekanntlich sowohl in Säuren als aucli in den sauer reagierenden Eisensalzlösungen'' löslich, was ja Bexda und M. Heidenhaix zur Differenzierung der Färbungen benutzten. Diese Verhältnisse benutzte ich analog dem (Tonerde-) ALinn- hämatein, wo ja auch der Farblack in Überschuß des sauer n renden Salzes löslich ist. Aus Gründen, die sich für den Kun^ tgej leicht aus den vorhergehenden Auseinandersetzungen ergeben, isi Farbwirkung der Lösung bei Verwendung des Eisenalauns als Lösungs- mittel entschieden günstiger, als wenn man Säuren verwendet. ') Der Einfachheit halber lasse ich den Eisenalaun den Sauerstoff liefern, aber auch andere Sauerstoffspender habe ich mit Erfolg angewandt. Man kann auch, wie ich getan habe, mittels Kaliumpermanganat das Häma- toxylin quantitativ oxydieren, so hoch man will. '-) Nicht bloß in Oxydsalzen, sondern auch in Eisenoxydulsalzen, auch in andern, z. B. Tonerdealaun, ist der Eisenlack löslich. XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 55 Die Ausprüfung der besten Farblösungen bat viele variierende Versuche mit Farblösungen und Probefärbungen erfordert, die ich aber hier übergehe, und es hat sich herausgestellt, daß die von mir färberisch ausgeprüfte Lösung einer ganz bestimmten Oxydationsstufe des Hämateins entspricht. Als für allgemeine Zwecke am meisten geeignet empfehle ich folgende Lösung: 1) 10 g reines Eisenalaun (Ferriammoniumsulfat) wird in der Wärme gelöst in 150 g destillierten Wassers; 2) 1*6 g Hämatoxylin wird in 75 g destillierten Wassers in der Wärme gelöst, diese Menge braucht zur Oxydation in Hämatein 4-34 = (2-71 + 1-63) g Eisenalaun. Das Hämatoxylin fällt nach der Auflösung nicht wieder aus beim Erkalten. Die beiden ganz kalten Lösungen werden vermischt, indem die Eiseualaunlösung in die Hämatoxylinlösung unter stetem Umrühren gegossen wird. Die Oxydation geht in der Kälte allmählich vor sich, die Farbe wird erst braun, dann blau, dann dunkelviolett; man erhitzt allmählich zum Kochen, um die Reaktion zu beschleu- nigen. Das Erhitzen nehme man in einer Porzellanschale oder in einem Kolben oder Becherglase vor, eventuell in dem Sandbade, man rühre nur mäßig um, damit die Luftoxydation nicht unkontrollierbar groß werde, wodurch die Farbe der Lösung olivengrün wird; wie man die zuweit gegangene Oxydation redressieren kann, darüber später. Es bildet sich so zuerst das Hämatein, hernach die höheren Oxydationsprodukte, und da gleichzeitig Lackbildung eintritt, ist in kurzer Zeit die Reaktion sicher beendigt; mau läßt nur kurze Zeit (^/o bis 1 Min.) sieden und hernach erkalten. Wünscht man das ge- bildete Ferrosulfat als Ferroammoniumsulfat in der Lösung zu haben, füge man 1*40 g Ammoniumsulf at hinzu, -wodurch die na6h- folgende Oxydation des Ferrosulfats in Ferrisulfat an der Luft nicht so rasch geht. — Die Farblösung soll eine dunkelbraune^ Farbe ^) Ist die Farbe versehentlich durch zu langes Kochen an der Luft zu oHvengrün geworden (Gegenwart von Ferrisalzen) , füge man der er- hitzten Lösung tropfenweise 10 Prozent Oxalsäure zu unter Umrühren, bis die Lösung den richtigen braunen Farbton erhalten hat (es ist nicht (ixal- saures Eisenoxydul), gleichzeitig wird dann der Niederschlag zuiu^p^wmi Teü aufgelöst worden sein. 56 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. haben, sauer reagieren und die größte Menge des gebildeten Eisentrioxybämateinlacks in Lösung halten. Ein geringerer Teil des Farbstofles ist nicht aufgelöst und in der folgenden Zeit fallen auch immer kleine Mengen aus. Ich habe gefunden , daß dieser Überschuß des Farbstoffes wichtig ist, die Farblösung färbt so besser , als wenn man z. B. durch Zusatz von Schwefelsäure die ganze Lackmenge in Lösung halten würde. In der Wärme löst sich der Niederschlag teilweise wieder auf, wel- ches Verhalten man gelegentlich benutzen kann, um intensiver zu färben. Fügt man der Lösung etwas Alkohol 10 bis 20 bis 30 cc hinzu, so bildet sich mit der Zeit etwas Aldehyd, und dies, ebenso wie der Alkohol, verlangsamt die Luftoxydation; gewöhnlich pflege ich es nicht zu tun. Nimmt man wesentlich mehr Eisenalaun, so erhält man dunkel- olivengrüne Lösungen , welche sich ziemlich klar halten , wenigstens nicht so viel absetzen. Eine solche Lösung enthält z. B. : 13 g Eisenalaun, 200 g destilliertes Wasser, 1 g Hämatoxylin. Sie färbt auch ganz brauchbar, aber lange nicht so gut wie die Lösungen, welche den dunkelbraunen Ton zeigen. Außer dem hier angegebenen habe ich systematisch viele andere aus den chemischen Verhältnissen sich ergebenden Kombinationen versucht, auch solche mit relativ mehr Hämatoxylin; für einige Zwecke sind diese mit viel Hämatoxylin intensiv diffus färbende Lösungen ganz wertvoll, aber ich führe sie für den allgemeinen Gebrauch nicht an. Die empfohlene Farblösung ist gut haltbar, ^ — mehrere Monate. Ein Bodensatz schadet wie gesagt gar nicht, aber vor dem Gebrauche ^) Obwohl die Farblüsung- sehr leicht herzustellen ist, und die Er- zielung der besten F a r b w i r k u n g immer das Hauptaugenmerk , die größere Haltbarkeit nur eine Nebenbedingung sein soll, will ich doch nicht unterlassen, eine theoretisch ganz interessante R e g e n e r a t i o n s m e t h o d e der Farblösung zu beschreiben. Wenn die Farblösung viel Bodensatz abgesetzt hat, und wenn die Farbwirkung bedeutend langsamer und schwächer wird (z. B. nach einigen Monaten) , beruht das auf einer durch die Luft bewirkten Oxydation des Ferrosalzes in Ferrisalz. Man schütte dann das Ganze in eine Porzellanschale, erwärme, und füge jetzt tropfen- weise ein wenig lOprozentige Oxalsäure hinzu unter ständigem Umrühren ; XXII, 1. Hansen: Über Hämatei'nlösungen und Cochenillefarblösungen. 57 filtriere man immer, sie setzt dann selbst bei der Färbung in Cuvetten in 24 Stunden keinen Farbstolfniederschlag ab. Aufbewahrt werde sie aber immer am besten über einem Überschuß des Farblackes und gut verschlossen. Die Farblösung läßt sich sehr vielseitig verwenden. Besonders schön ist die tief schwarze Ker n -(Chromatin-) färb uug, aber auch die scharfe Darstellung mancher Plasmastrukturen (des Trophospongium z.B.), der Kittleisten, Bürstensäume etc. ist vorzüglich. Es ist wesentlich eine S c h u i 1 1 f ä r b u n g , sie geht gewöhnlich auch in der Kälte sehr schnell vor sich. Man kann kurz, Minuten, oder länger. Stunden, bis 24 Stunden färben; in letzterem Falle wird sehr stark überfärbt, aber nicht alle Elemente gleichstark (so daß ich gelegentlich gar nicht die (tagelange) Färbung habe differenzieren brauchen), hernach kann man in der üblichen Weise differenzieren, am besten mittelst verdünnter Säuren (Schwefelsäure , Essigsäure- Benda). Gewöhnlich genügt die kurze Färbung ohne nach- trägliche Differenzierung. Zweckmäßig ist es dann oft, die Schnitte in der Farbtlüssigkeit kurz zu erwärmen (bis 40 oder 50°); gutfixiertes Material, gut aufgeklebt, verträgt in den meisten Fällen ohne den geringsten Schaden eine etwas höhere kurzdauernde P>wärmung, wie ich vielfach beobachtet habe. Nach der Färbung wird in destilliertem Wasser abgespült und ausgewaschen, nach Belieben, 5 bis 10 Minuten, nachher wie gewöhnlich in Leitungs- wasser ausgewaschen und dann, wie üblich, in Balsam übergeführt. Gewöhnlich ist auch nach dieser kurzen Färbung die Differenzie- rung der Schnitte und die Nuancierung eine vorzüg- liche. Auch die Centrosomen lassen sich durch diese Farblösung darstellen , doch bekommt man sie so nicht elektiv isoliert gefärbt. Wünscht man sie besonders darzustellen, so verfahre man ent- weder nach der Heidenhain sehen oder ßENDASclren Methode, oder man überfärbe in meiner Farblösung stundenlang (eventuell 24 Stunden) und differenziere nachher wie allgemein üblich. sobald alles Ferrisulfat durch die Oxalsäure in Ferrosulfat wieder reduziert worden ist, ist der Bodensatz fast wieder aufgelöst, die Farbe der Lösung ist tief kaffeebraun geworden und sie färbt jetzt wieder kräftig und gut, anscheinend ein bißchen brauner als ursprünglich, aber durch Abspülung der Schnitte mit destilliertem Wasser (und nachher Leitungswasser) wird alles wieder schwarz im Ton. 58 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. Die Färbung mittelst dieses Eisenhämateins läßt sich sehr wohl mit den meisten anderen Färbungen kombinieren. Die Kernfärbung ist sehr resistent, verträgt z. B. Säurefuchsin- Pikrin (nach meiner Methode) etc. anstandslos , natürlich auch Eosin , Erythrosin , Licht- grün etc. Wünscht man mehr r e i n e K e r n f ä r b u n g oder n u r eine solche, so setze man bestimmte kleine Quantitäten freier Schwefelsäure zu. Folgende Mischungen kann ich empfehlen: A. Eisenhämateinlösung 4 cc 1 Prozent Schwefelsäure 1 „ also ein Zusatz von 2<>/oo H2SO4. Man erhält so weniger Plasmafärbung, doch gleich intensive und rfe K Mischung;: scharfe Kernfärbung. Noch mehr isolierte Kernfärbung gibt folgende B. Eisenhämateinlösung 4 cc 1 Prozent Schwefelsäure 2 „ (ca. 3-30/00 H,3 SO,). Man färbt am schnellsten, wenn man die Farblösung erwärmt; durch Behandlung mit dünner, 2 bis 3 pro Mille Schwefelsäure läßt sich jeder Grad von isolierter Kernfärbung erhalten. In den meisten Fällen ziehe ich die Hauptfärbung allein mit ihren reichen Nuancierungen der reinen Kernfärbung absolut vor. Auch als gewöhnliche Arbeitsmethode ist sie ihrer Leichtigkeit und Haltbarkeit und sonstigen guten Eigen- schaften wegen aufs wärmste zu empfehlen. Detaillierte Angaben über die Anwendung auf verschiedenes Material, bei verschiedener Fixierung etc. zu machen, halte ich für überflüssig, doch besonders hervorheben will ich, daß auch sonst schwierig färbbares Material damit oft gut gefärbt werden kann. Über die chemischen Vorgänge bei der Bereitung dieser P^isen- hämateinfarblösung habe ich schon oben einige Angaben gemacht. Um Genaueres darüber zu erfahren, habe ich systematisch viele quan- titative Versuche angestellt. Die wichtigsten Resultate werde ich hier kurz mitteilen. Ich halte mich aber nur an die gröberen chemischen Verhält- nisse, die gefundenen Resultate gelten in dieser Beziehung auch für andere analoge Eisenverbindungen als den Eisenalaun. XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 59 Da ich nicht in der Lage war, Elementaranalysen der ver- schiedenen Lacke zu machen, griff ich zur Untersuchung- der Oxyda- tionsprodiikte des Hämateins mittels der stufen weisen Oxy- dation. Ich behandelte eine abgewogene Menge Hämatoxylin (resp. Hämatein) mit bestimmten Mengen von Ferrisalz und oxydierte vorsichtig so weit (eventuell in der Wärme), bis sich kein Ferrisalz mit der Rhodankaliumreaktion in der wässe- rigen Lösung mehr nachweisen ließ. Die Lösung enthielt dann nur Ferrosalze und die freigewordene Schwefelsäure (siehe die Oxydationsgleichung oben) , und mit den also gewonnenen Lösungen von bestimmter Zusammensetzung wurden Probefärbungen auf gleich- artigem Material gemacht. Ich betrachte vorläufig die Sache so, als ob ich mit jedem disponiblen Sauerstoffatom zwei der disponiblen Wasserstoffatome des Hämatoxylins resp. Hämateins oxydiere , und diese hypothetischen Oxydationsstufen benenne ich einfach so: Hämatoxylin -^ H., = Hämatein. Hämatein ^ Hg = Dioxyhäiuatei'n. Hämatein -i- Hg = Trioxyhämatein. Hämatein — H^ = Tetraoxyhämatein etc. Mit der fortschreitenden Oxydation des Hämateins stellten sich gesetzmäßige Farbenänderungen ^ ein, welche sich in analoger Weise und noch deutlicher bei den Chromlacken ^ zeigen; darüber später. Allein maßgebend ist hier die Oxydationsstufe des Hämatoxylins ; man erhält nämlich ganz analoge Resultate , wenn mau das Häma- toxylin in Lösung mit einer berechneten Menge. Schwefelsäure (um neutrale Salze zu bilden) und mit anderen Oxydationsmitteln quan- titativ oxydiert und dann mittels Ferrosalzen (Eisensulfat, Mohrs Salz) oder mittels Chromidsalzen die Farblacke bildet. Um ein G r a m m ^ Hämatoxylin i n H ä m a t e i n zu oxy- dieren , braucht man 2'7 1 g F e r r i a m m n i um s u 1 f a t ; damit werden bekanntlich zwei Wasserstoffatome wegoxydiert, für jedes folgende Wasserstoffatom braucht man 1"355 g Eisenalaun. Zur Auflösung der Substanzen wird nur ausgekochtes, sauerstoft- ') In der technischen Färberei ist es eine altbekannte Tatsache, daß mit steigender Oxydation an der Luft die Eisenhämatoxj'linlacke erst bläulich, dann schwarz und zuletzt bräunlich und minderwertig werden. ^) Auch bei Tonerdelacken. ^) Die Gewichtsmengen sind mit einer Genauigkeit von + 2-5 mg an- gegeben, was hier völlig genügt. 60 Hansen: Über Hcämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. freies, destilliertes Wasser benutzt. Es läßt sich zeigen, daß Hämatein in schwach saurer Lösung mittels also bestimmter Mengen Kalium- permanganats (oder titrierten Wasserstoffsuperoxyd) oxydiert , in diese hölieren Oxydationsprodukte übergeführt wird ^ ; bringt man dann solche höher oxydierte Lösungen (in sauerstofffreiem Wasser) mit J'errosalzen zusammen, so werden sie nicht reduziert, so daß sich kein F e r r i s a 1 z bildet. Es läßt sich also bestimmt schließen, daß, wenn (bei der Oxydation des Hämatoxylins mittels Ferrisalzen) bei der Rhodankaliumreaktion kein Ferrisalz mehr nachgewiesen werden kann, dasselbe all seinen disponiblen Sauerstoff an das Häma- toxyliu abgegeben hat, wenigstens werde ich dies so lange annehmen, bis ich widerlegt werde. Von den vielen Versuchen führe ich hier einige an, wobei man mir eine kleine Wiederholung des Ferrohämateins gestatte. 1. F e r r oh ämat ein (cf. auch oben) = Hämatoxylin -^ H._,. 1*355 g Eisenalaun werden in 40 cc Wasser, und 0'50 g Hämatoxylin in 10 g Wasser gelöst ; beide Lösungen vorsichtig ver- mischt, geben folgende Oxydationsphasen. Zuerst bildet sich Häma- tein, welches die Lösung tiefbraun färbt, aber schnell fängt sie an violett zu werden, indem nun die Ferrolackbildung anfängt und gleich- zeitig ein Teil des gebildeten Lackes als ein schwarzer amorpher Niederschlag sich absetzt, auch an der Oberfläche zeigt sich eine glänzende Haut. Die Lösung färbt jetzt sogleich, wie oben angegeben, Kerne schwarz bis schwarzviolett, Plasma mehr violett. Die Färbung wird durch Ferrosulfat nicht verändert. Fügt man 10 g Ferro- ammoniumsulfat in 50 g sauerstofffreiem Wasser hinzu , erhält man eine dunkelviolette Lösung, indem der Niederschlag darin größten- teils aufgelöst wird. In dieser Lösung läßt sich keine Spur von Ferrisalzen nachweisen; sie färbt wie oben an- gegeben. Wir haben also hier eine Verbindung (Lack) des gebildeten Häma- teins mit dem Ferrosalz, welche schwarzviolett ist. Es erhellt hieraus, daß Ferroh ä matein die eigentliche Farbe ist und nicht ein Ferrihämatein. Und ich habe die besten Gründe, anzunelimen, daß die Ferrolacke liier die eigentümlichen, wertvollen Farblacke sind. ^) Die Reaktion muß ganz abgelaufen sein, eventuell durch Erhitzen der Lösung. XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen, gl daß dagegen die Lacke, welche Fernverbindungen enthalten, minder- wertige Farben sind. Das geht auch aus den Prozessen der tech- nischen Färberei hervor. Bestätigt wird diese Ansicht durch das Verhalten der Ferro- lacke der höheren Oxydationsstufen. Nehmen wir einstweilen meine willkürliche vorläufige Nomen- klatur an, und bezeichnen wir ein Hämatein, welches mit 1 Atom Sauerstoff weiter oxydiert wird (also möglicherweise 2 Atome Wasser- stoff verliert), als D ioxy hämatein , so können wir eine solche Lösung folgendermaßen bereiten. 2. F e rr odioxy h am at e in. a) 1 g Hämatoxylin in 50 g Wasser gelöst; b) 5*42 g Eisenalaun in 100 g Wasser gelöst. Die Lösungen werden gut abgekühlt , eventuell zur Zurück- drängung der Hydrolyse in der Eisenalaunlösung wird derselben ca. 0*8 g Schwefelsäure^ zugefügt. Die Eisenalaunlösung wird in die Hämatoxylinlösuug unter stetem Umrühren gegossen. Die Lösung färbt sich zuerst vorübergehend braun (Bildung von gelöstem Häma- tein!), hiernach dunkelviolett, wie oben beim Ferrohämatein. Es lassen sich in diesem Stadium" noch reiclilich F e r r i s a 1 z e nachweisen, und erst nach und nach in der Kälte geht die Oxydation in Dioxyhämatein (Lack) vor sich. Durch Probefärbung in diesem Stadium erhält man immer einen mehr violetten Ton. Erhitzt mau aber, geht die Reaktion weit schneller, und nach kurzem Kochen ist die Oxydation in Dioxyhämatein voll- ständig, wenn sich kein Ferrisalz mehr nachweisen läßt.^ (NB. Verwendung von sauerstofffreiem Wasser. Die Oxydation au der Luft kommt beim kurzen Kochen in den Kolben nicht in Betracht.) ^) Also z.B. 8 cc von 10 Proz. H2SO4 Lösung; man kann dasselbe unterlassen oder die Schwefelsäure der Hämatoxylinlösung vorher zufügen ; das ändert an dem Resultate nichts. Nur hält sich der Lack viel reich- licher in der Lösung mit mehr Schwefelsäure aufgelöst. ■^) Auch Probefärbungen (kalt!) wurden gemacht, wir haben hier noch mit dem Ferrohämatein zu tun. ^) Sind die zwei Lösungen vor dem Vermischen nicht genügend ab- gekühlt, bekommt man sofort Lackbildung und Oxydation zu Dioxyhäma- tein, so daß man das Stadium der braunen Hämateinfarbe und die violette Ferrohämateinlackbildung gewöhnlich nicht sieht. Für die Praxis ist dies natürlich gleichgültig. 62 Hansen: Über Hämatei'nlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. Die Lösung ist dunkelbraun von dem richtigen Ton und enthält ge- wöhnlich noch etwas ungelösten Lack (so daß man vor dem Gebrauche filtrieren muß) , welchen man eventuell durch etwas Schwefelsäure- zusatz auflösen kann. Die Lösung enthält nur Ferosalze. Die Probefärbung (sauerstofiYreies Wasser) gibt tiefschwarze Kerne , Plasma ebenso weit schwärzer als bei Ferrohämatein, aber doch immer mehr violett als die folgende Oxydationsstufe. — Wünscht man alles bei der Reaktion auftretende Ferrosulfat in das haltbarere Mohr sehe Salz zu überführen, so setze mau vor oder nach der Reaktion die berechnete Menge Ammoniumsulfat hinzu (bei den angegebenen Mengen also: 0"73 g (NH^jg SO^), auch scheint hierdurch etwas mehr Lack in Lösung zu gehen , die Farbe der Lösung wird brauner. — Eine rein schwarze, resp. grauschwarze Färbung des Plasmas er- hält man nur an einer noch höheren Oxydationsstufe. Oxydiert man im Sinne des oben Gesagten fünf Wasserstotfatome des Hämatoxylins — also drei des Hämateins, so erhält man 3. das Tri oxy h ä ma t e in. Diese Oxydationsstufe ist von mir als die zweck- mäßigste empfohlen; die oben angegebene „ Eisen - liäm at einlösung" enthält diese Stufe, und zwar so, daß kleine Abweichungen von den genauen Quantitäten in der Zusammensetzung durchaus nicht schaden. ^ Man bildet sie folgendermaßen : 1 g Hämatoxylin in 50 g Wasser, 6'78 g Eisenalaun in 100 g Wasser gelöst (dazu 0*6 bis 0'8 g Schwefelsäure). Die Lösungen werden wie oben vermischt, man erhitzt, bis die Proben kein Ferri- salz mehr bei Rhodankalium zeigen, hiernach kühlt man ab und fügt 0*93 g Ammoniumsulfat hinzu. Die Lösung enthält nun Trioxy- hämateinferrolack, Ferrosalze und freie Schwefelsäure. Sie färbt sehr intensiv , ganz analog der empfohlenen Lösung und absolut schwärzer als das D i o x y h ä m a t e i" n. ^) Da die nächsten höheren Oxydationsstufen auch schwarz färben, obwohl je höher um so minder kräftig, sieht man, daß das Färbvermögen der angegebenen Lösung vorerst nicht besonders von der unvermeidlichen nachträglichen Luftoxydation beeinflußt wird, je kälter um so haltbarer, je mehr in der Flasche ist, ebenso. XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 63 Höher mit der Oxydation zu gehen , hat keinen Vorteil. Ich habe sowohl die Tetraoxy-, Pentaoxy- und Hexaoxyhäma- te in eisenlacke geprüft. Sehr brauchbar ist noch das Tetra- oxyhämatein , es hat aber keinen Vorteil vor dem Trioxyhämatein. Mit noch höherer Oxydation wird die Färbekraft geringer und die Töne minderwertig, oliven, bräunlich etc. Der in der Lösung gebildete Eisenlack wird , wie gesagt , zum Teil von der bei der Oxydation des Hämatoxylins freigewordenen Schwefelsäure in Lösung gehalten und extra Schwefelsäurezusatz ^ löst den Niederschlag mehr und mehr auf, über eine gewisse Grenze hinaus erhält man dann, wie oben gesagt, mehr reine Kernfärbung. Nicht allein in der also besprochenen Weise lassen sich diese Ver- hältnisse dokumentieren. Ich habe beispielsweise auch das H ä m a 1 X y 1 i n gesondert in Lösung in die verschie- denen Oxydationsstufen überführt,^ und hernach die Lösung mit einer entsprechenden Menge Ferrosalz vermischt und eventuell die angegebene Menge Schwefelsäure zugefügt. Man erhält bei diesem Verfahren ganz dieselben Resultate wie mit Eisenalaun- oxydation. Sehr schön beobachtet man die L a c k b i 1 d u n g , wenn man eine Lösung von Dioxy- oder Trioxyhämatein in Wasser bereitet und dann in vollgefüllter , gutverschlossener Flasche aufbewahrt (so daß nachträgliche Luftoxydation ausgeschlossen ist). Nach einigen Tagen mischt man die Lösung mit einer entsprechenden Ferrosalzlösung. Sind die Lösungen kalt, tritt die Lackbildung oft sehr langsam ein, so daß man energisch kochen muß , um die Lacke völlig zu bilden. Weit leichter zu beobachten als beim Eisenhämatein ist dies Verhalten bei den Chromalaunhämateinen und auch bei den Thonerdelacken, sowie bei Chromcochenillen. Fasse ich meine Ergebnisse zusammen, die auch zum Teil in noch auffälligererWeise für Chromalaun- und Thon- erdealaunlacke gelten, sind es folgende: ^) Es ist vorteilhafter die vermehrte Lösung des Lackes durch einen Schwefelsäurezusatz zu erreichen als durch einen größeren Gehalt an Eisen- alaun, wodurch die Färbungen, wie leicht verständlich, ungünstig be- einflußt werden. 2) Mit den berechneten Mengen von Kaliumpermanganat in saurer Lösung, oder mit andern Oxydationsmitteln. 64 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. Hämatosylin bildet schwach gefärbte oder farblose Lacke. Häma- tein bildet die für die respektiven Metalle b 1 a u e s t e n Lacke. Mit zunehmender Oxydation werden die Nuancen immer dunkler, resp. violett oder schwarzblau, schwarz, zuletzt bräunlich. Hämateiuferrolack ist dunkelviolett. Dioxyhämatein- und Trioxy- hämatein- sowie Tetraoxyhämatei'n-Eiseulack ist schwarz, hernach be- kommen die Farben einen bräunlicheren Stich. Die für die Mikrotechnik wertvollen Eisenhäma- teine müssen hier als Ferro verbin düngen^ aufgefaßt werden. Ferriverbindungen sind minderwertig. Zuletzt mag nicht unerwähnt bleiben , daß der Schleim oft eine Metachromasie mit purpurviolettem Ton zeigt bei der Färbung mit Eisendioxy- und Trioxyhämatein. Die Metachromasie zeigt sich am ausgesprochensten im Wasser , wird aber durch die Alkoholbehandlung größtenteils zerstört und ist praktisch ohne Be- lang. Auch bei den Chrom ala unhä mateinen findet man ähn- liche Verhältnisse. Für Stückfärbung habe ich diese Eisenhämateine nicht em- pfohlen , sie werden sich aber gewiß bei passendem Schwefelsäurezusatz sehr wohl verwenden lassen können. Je nach Fixation und Material und den gewünschten Resul- taten (reine Kernfärbung oder auch diffuse Färbung) muß der Schwefel- säurezusatz ein leicht auszuprüfender sein (s. oben). Zum Auswaschen muß am besten Sauerstoff freies, ausgekochtes Wasser verwendet werden , ebenso fülle mau die Gläser ganz voll, um Luftoxydation zu vermeiden, oder absorbiere den Sauerstoff durch einen mit Pyrogalluslösuug befeuchteten Wattebausch , der durch eine Zwischenlage von hydrophober Watte am Heruutergleiten ver- hindert wird. n. Die Chromhämateine. Die Chromlacke des Hämatoxylins oder richtiger der Hämateine und Oxyhämateine sind technisch sehr wichtig , weil sie so wider- standsfähig sind. In der Mikrotechnik spielen sie (abgesehen von den Färbungen des Nervensystems) wenigstens keine so große Rolle, wie sie verdienen. II ^) d. h. sie enthalten das zweiwertige Eisenatom Fe. XXII, 1. Hansen: Über Hämatei'nlösungen und Cochenillefarblösungen. 05 Ihre bekannteste bewußte Anwendung ist die R. Heidenhain sehe Chromhämatoxylinfärbung-. Die nicht wenigen Rezepte hierzu brauche ich hier nicht zu wiederholen. Beizung der Gewebsstücke (oder Schnitte) mit Lösung von Chromaten oder Bichromaten und darauf- folgende Behandlung mit Hämatoxylinlösungeu (auch umgekehrt) ist das Wesentlichste. Dagegen ist die Anwendung von Chromidsalzen^ meines Wissens nicht gebräuchlich, — • z. B. Chromalaun oder Chromisulfat in Ver- bindung mit liämatoxylin analog dem Tonerdealaunhämatoxylin wird nicht augewandt. Tatsächlich gibt auch ein analog konstruiertes Chromalaunhäma- toxylin zunächst ganz schlechte oder minderwertige Resultate. Trotzdem ist es mir durch einfache Mittel gelungen , Chrom- alaunhämateine von vorzüglicher Brauchbarkeit und Färbekraft herzustellen. Die Verwendbarkeit derselben wird sehr allgemein werden können, weil sie vielfach weit besser als die gewöhnlichen Tonerdehämateine wirken und weit widerstands- fähiger sind. Zunächst nur ein paar orientierende Bemerkungen über die Chrom- lacke und Chrombeizen. Es ist bekannt, daß Chromidoxyhydrate oder alle Chromidsalze (z.B. Chromidsulfat, Chromalaun) die relativ stabilsten Chromverbindungen sind. Durch viele Reduktionsprozesse erhält man aus Chromsäure^ Bichromsäure und deren Verbindungen zuletzt Chromoxyd-(Chromid-) Verbindungen. Fixiert man beispielsweise in der Mikrotechnik die Ge- webe in Chromsäure , Chromaten oder Bichromaten, erhält man zu- erst gelbliche Verbindungen dieser Oxydationsstufe , hernach tritt in den Geweben eine braune Verbindung, welche größtenteils Chrom- dioxyd (CrO.,) oder Chromi Chromat (Cr^Og'CrOg) ist, auf. Die- selbe bildet sich auch bei Belichtung von „Chromgelatine" in der Photographie, wodurch die Gelatine unlöslich wird, ferner zuerst durch Reduktion von Chromaten, besonders Bichromaten (Müllers Flüssig- keit etc. !) in den Geweben (und auch mit Alkohol im Lichte als ein brauner amorpher Niederschlag) , welche durch langes Auswässern weiter zersetzt wird. Es ist klar, daß diese Verbindung, welche noch imstande ist, Sauerstoif abzugeben (und dabei in Chromoxyd über- *) Abgesehen von den Weigert sehen Gliafiirbungen als Beize. Zeitschr. f. wiss. Mikroskopie. XXII, 1. 5 66 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. geht), auch Hämatoxylin in Hämatein und Oxyhämateiu zu oxydieren vermag. Auf diesem Verhalten beruht die gewöhnliche schwarze oder blaue „Chromhämatoxylin"-Stückfärbung. Nach genügend langer Zeit und besonders beim Verweilen des chromfixierten Gewebes in Alkohol geht die Reduktion des Chromi- chromats weiter, und zuletzt ist alles in Chromoxyd übergeführt, wir haben dann die bekannten grünen resp. graugrün gefärbten Gewebs- stücke, in welchen jetzt alles Chrom als Chromoxyd -(Chromid-) Verbindungen gebunden ist. Solches Material vermag nicht mehr Hämatoxylin zu oxydieren. Genauer auf die möglichen Formen einzugehen , in denen die Chromidverbindungen vorkommen könnten, halte ich für überflüssig; jeder einigermaßen chemisch Geschulte weiß, daß die Oxydationsstufe dem Chromoxyd entspricht, aber zugleich, daß wahrscheinlich sehr komplexe Verbindungen vorliegen, mau mag dieselben in rein quanti- tativer Hinsicht wohl größtenteils als basische Verbindungen — Salze , Hydroxysalze — auffassen , aber molekular ist die Sache so einfach nicht. Ich brauche nur auf das höchst eigentümliche Ver- halten der grünen Chromisulfatlösungen hinzuweisen oder auf die sehr verschiedenen Löslichkeitsverhältnisse des Chromidhydroxyd.^ Mikrotechnisch wichtig ist die Tatsache, daß „gut fixiertes Ge- webe" sich vorzüglich färbt; und das sind eben solche Gewebe, in welchen bei genügend langer Einwirkung der Chromsalze sich Chromid-Chromate oder basische Chromidverbindungen genug gebildet haben, worauf die Farbstoffe sich fixieren können. Die gute Färb- barkeit der Formol-Bichromatmischungen beruht ebenfalls auf der in gleichem Sinne, aber schneller sich zeigenden Reduktionswirkung des Formaldehyds auf die Bichromate. Verwendet man Tonerdealaunhämateiue (z. B. die von mir 1895 angegebene voll oxydierte Lösung) , so färben sich die auf diese AVeise gut chromierten Gewebe besonders kräftig. Ebenso werden die meisten Mikroskopiker erfahren haben, daß solche Präparate besonders haltbar sind. Mir wenigstens ist immer die weit größere Widerstandsfähigkeit der gleichen Präparate (auch gegen Licht) aufgefallen. Diese Sache verhält sich , wie ich aus meinen Untersuchungen entnehme, sehr wahrscheinlich so, daß sich das Hämatein, der Ton- ^) Auf die wichtige Rolle, welche das Licht bei den Beizprozessen mit Chromverbindungen spielt, brauche ich nur hinzuweisen. XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 67 erdelack zum Teil , mit dem Chromoxyd des fixierten Gewebes ver- bindet, so daß wir nicht reinen Touerdehämateiulack , sondern in verschiedenem Grade Chromoxydhiimateinlack gleichzeitig erhalten; und die Chromhämateiulacke sind weit widerstandsfähiger und auch dunkler als die Tonerdelacke. Als Ausgangspunkt für die Chromhämateine wählte ich den Chromalaun: Cr.-, (80^)3, K., 80^ -(- 24 H^O, der mir die meisten Vorteile zu bieten scheint; erstens weil er, wie der Versuch lehrt, sich relativ leicht mit den Geweben vereinigt (energisch beizt), zwei- tens mit den Oxydationsprodukten des Hämateins intensiv gefärbte Lacke von hohem Färbevermögen bildet. Durch Kochen geht bekanntlich das violette Salz in das grüne über, und ich habe prinzipiell immer die grüne Modifikation verwendet, indem ich die Lösungen kochte. Übrigens ist die Lösung immer etwas hydrolysiert, was für die Beizung und Färbung wichtig ist. Bei genügend langer Einwirkung werden die Gewebe stark gebeizt (besonders bei 30 bis 35 Grad), darüber später. Wünscht man stärkeres Beizen, verwendet man am besten Lösungen von soge- nannten basischen Chromisulfaten. Mau erhält z. B. ein Salz : Cr^ (80^)3 (OH)g , wenn die Lösung von Chromalaun mit frischgefälltem Chromoxydhydrat behandelt wird. Auch mittels Ammoniumhydrat oder kohlensauren Alkalien er- hält mau ein basisches Salz , Cr., SO^ (OH)^ . Es bildet sich zuerst ein Niederschlag (von Chromihydrat) , welcher sich wieder auflöst unter Bildung von „basischen"^ Salzen. Solche Lösungen halten sich bei passender Zusammensetzung sehr lange und vertragen auch das Kochen, ohne daß sich die basischen Salze ausscheiden. Um eine gut färbende Chromalaunhämateinlösung herzustellen, habe ich gefunden, daß die Lösung am besten etwas (nicht besonders viel) basische Chromver- bindungen enthalten soll, und daß sich die höheren Oxydationsprodukte des Hämateins vorteilhafter als das Hä matein selbst anwenden lassen. *) Das wenigstens bei der Ammoniakbehandlung sich sehr komplizierte Verbindungen bilden, ist bekannt; für unsere Zwecke dürfen wir aber die Verhältnisse zunächst so auffassen, als ob einfach basische Verbindungen wirklich in der Lösung wären. 68 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. Hämatoxylin und Chromalaun geben keine Farblösung- ; das tun erst die Oxydationsprodukte von dem Hämatein aufwärts (cf. früher). Zur Oxydation des Hämatoxylins kann man, wie ich andernorts be- sprochen habe, viele verschiedene Oxydationsmittel anwenden, sobald man bewußt quantitativ verfährt, wie in der Mikrotechnik^ des Hämatoxylins ich es 1895 zuerst empfohlen und getan habe. Beispielsweise kann man die berechnete Menge übermangan- sauren Kalis verwenden, aber am besten gebraucht man hier das Kaliumbichromat in der berechneten Menge. Also wird eine bestimmte Menge Chromalaun in Wasser gelöst und gekocht, bis die Lösung ganz grün wird, hiernach löst man das Hämatoxylin entweder direkt in der warmen Chromalaunlösung, was sehr schnell geht, oder das Hämatoxylin wird gesondert in destilliertem Wasser gelöst und der Chromalaunlösung zugefügt. Man läßt er- kalten" und setzt hiernach die berechnete Menge Bichromas kalicus (gelöst) hinzu unter stetem Umrühren. Die Oxydation beginnt sogleich , es ist aber notwendig zum Kochen zu erwärmen , um die Oxydation schnell durchzuführen und besonders um die Chromlackbildung zu beschleunigen. Es wird das Bichromat durch das Hämatoxylin in Chromidverbindungen reduziert, indem es seinen disponiblen Sauerstoff abgibt. Die Reaktion, welche in saurer Lösung verläuft, ist bekanntlich folgende : K, Cr, 0, -f 4 H, SO^ = K, SO,, Cr, (SOJ.^ + 4 H,0 -f 0. 3- Kaliumbichromat Chromalaun Die Schwefelsäure wird von dem vorhandenen Chromalaun ge- liefert, d. h. es bilden sich eben durch die Oxydation des Hämatoxylins die für die Färbekraft der Lösung wichtigen basischen Salze. Ganz ähnlich basische Salze bilden wird das übermangansaure Kali, wie ich 1895 im Zoologischen Anzeiger No. 473 gezeigt habe, und dasselbe gilt von andern ähnlichen Sauer- stoifspendern. Verhindert man durch einen berechneten Schwefelsäurezusatz die Bildung von basischen Salzen , so ist die Lösung zwar selbst gleich intensiv gefärbt , aber sie färbt die Gewebe schlecht oder gar nicht. 1) Zool. Anz. No. 473, 1895. -) Indem man die Schale oder den Kolben in kaltes Wasser stellt. XXII, 1. Hansen: Über Hämate'mlösungen und Cochenillefarblösungen. 69 Dadurch ist uns ein ausgezeichnetes Mittel in die Hände gegeben, die Färbung zu modifizieren. Ohne Säure- zusatz färbt das Chromalaunhämatein die Kerne intensiv, und außer- dem sehr stark auch die Zwischensubstanzen und das Plasma (also mehr diffus). Bei geeignetem (s. unten) Schwefelsäurezusatz kann man aber z. B. eine sehr intensiv reine Kernfärbung er- zielen. Die Chromalaunlösung ist immer etwas hydrolysiert, sie ent- hält, um rein quantitativ zu reden, gelöstes Chromhydroxyd ^ und etwas hydrolytisch abgespaltene Schwefelsäure. Nun ist aber die Beizwirkuug (also auch die Fixierung des Farbstoffes auf dem Ge- webe) eng mit dem Vorhandensein von disponiblem Chromhydroxyd verknüpft. Drängt man also die Hydrolyse durch Schwefelsäure- zusatz zurück, ward die Färbung auch zurückgehen, die Verbindung des Farblackes mit dem Gewebe wird dissoziiert nach dem Gesetze der Massenwirkung ; " zuerst natürlich in den lockeren Verbindungen, zuletzt in den Kernen. Es ergibt sich ferner hieraus, daß man durch geeignet gewählte Verhältnisse zwischen dem Farblack, der Chrom- alaunmenge und dem Schwefelsäurezusatz Stückfärbungen erhalten kann , wobei man fast beliebig lange die Färbung ausdehnen kann, ohne daß störende Überfärbung eintritt, es läßt sich eben dadurch der gewünschte Punkt der Färbung, wo die färbenden und ent- färbenden Kräfte der Lösung im Gleichgewicht miteinander sind, im voraus genau bestimmen. Ich habe das praktisch bestätigt gefunden. Da die Hydrolyse ebenso wie die Reaktionsgeschwindigkeit mit zunehmender Temperatur wächst, wird die Färbung der Gewebe ungemein durch Er- wärmung beschleunigt. Daher ist Brütofentemperatur oft sehr geeignet und die meisten gut fixierten Gewebe vertragen allgemein ohne Schaden kürzere Temperatursteigerungeu der Farblösung von 50 bis 60^, ja bisweilen noch höhere, wie ich vielfach konsta- tiert habe. Ich hebe nochmals hervor, daß ganz wie hier auseinander ge- setzt die Verhältnisse beim Eisenalaunhämatein liegen, bei dem Ton er dealaunhä matein, sowie b'fci dem später zu erwähnenden M a n g a n h ä m a t e in. ^) Daß die Verhältnisse aber molekular weit koiupHzierter sind, ist oben gesagt. -) Vgl. „Den Hyaline Bruskgrundsubst." 1900 und „Der Hyalinknorpel" I, Anat. Hefte, H. 83, 1905. 70 Hansen: Über Hämatei'nlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. Es gelten ferner ähnliche Überlegungen für Eisenalaun Cochenille, Tonerdealaimcochenille und Chromalauncochenille (resp. Karmin) etc. Über die Oxydationsstufen des Hämatoxylins ist noch zu sprechen ; ähnlich dem vorher beim Eisenalaunhämatein Gesagten kann man außer dem Hämatein auch die von mir provisorisch so genannten Oxyhämateiue verwenden. Es bestehen hier ja ganz gesetz- mäßige Verhältnisse. ^ Chromalaun hämatein gibt eine rein himmelblaue Färbung. Chromalaundioxy hämatein gibt eine intensiv dunkelblaue, resp. schwarzblaue Färbung und ist für den allgemeinen Gebrauch am meisten zu empfehlen. Noch mehr schwarzblau färbt Trioxyhämatein. Wünscht man ganz schwarze Färbungen (der Kerne z. B.) , so verwende man Tetraoxy- oder Pentaoxyhämatein. Bei noch höherer Oxydation verliert die Farbe an Kraft und wird mehr bräunlich. Die P"'arblösungen lassen sich auch so herstellen , daß mau das Hämatoxylin in wässeriger Lösung für sich oxydiert, z. B. mit Kalium- bichromat oder übermangansaurem Kali (s. später), die Lösung muß alsdann die berechneten Mengen Schwefelsäure enthalten, damit sich neutrales Mangansulfat bildet, resp. Chromidsulfat. Dann gieße man die kalte Chromalaunlösung und die Hämateinlösung zusammen und erwärme bis zur Lackbildung. Um so gut färbende Lösungen daraus zu erhalten, muß man entsprechend dem oben Gesagten soviel Alkali oder frisch gefälltes Chromhydroxyd zu der kalten Lösung setzen, daß die der Hämateinlösung extra zugefügte Schwefelsäure neutrali- siert wird , d. h. daß die Farblösung genügend basische Salze ent- hält. — Je frischer die Hämatein- oder Oxyhämateinlösungeu bereitet ^) Siehe auch oben über die Nomenklatur ; Hämatein = Hämatoxylin -^ H.,. Werden in Hämatein weitere 2 H oxydiert erhält man Dioxyhämatein. „ „ „ „ 3 H ,, n n Trioxyhämatein. ., „ „ ., 4 H „ ,, „ Tetraoxyhämatei'n. ., ., „ „ 5H ,, „ ., Pentaoxj^hämatein. „ „ „ „ 6 H „ 77 n Hexaoxyhämatein. Diese Namen sind nur für die Beschreibung der bei der stufenweisen Oxy- dation erhaltenen Produkte rein provisorisch gewählt, sonst prätendieren sie nichts. XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 7 1 sind, um so schneller tritt die Lackbildung ein. Je höher das Häma- tein oxydiert ist, um so langsamer die Lackbildung. L<äßt man die wässerigen Hämatein-, resp. Oxyhämateinlösungen längere Zeit in ganz vollgefüllten Flaschen gut verschlossen stehen, so daß jede nachträgliche Oxydation ausgeschlossen ist, so erfolgt die Lackbildung um so schwieriger und langsamer, je älter die Lösung, so daß man gelegentlich sehr energisch kochen muß, damit sie ein- tritt. Vielleicht haben sich die Hämateinmoleküle miteinander ver- kettet , polymerisiert , kondensiert , so daß diese Bindungen erst ge- sprengt werden müssen, ehe die Lackbilduug eintreten kann, welche bei frischer Lösung durch keine solche Verkettungen verzögert wird. Auch bei Tonerdealaunlacken begegnet man den hier mitgeteilten Unregelmäßigkeiten bei Anwendung älterer Lösungen von Hämatein. Praktisch nehme ich immer die Oxydation des Hämatoxylins in der Chromalaunlösung vor, ebenso wie ich in der von mir 1895 angegebenen Tonerdealaunhämateinlösung gemacht habe , ein Ver- fahren, das entschieden besser ist als das Hämatein oder Hämatein- ammoniak vorher darzustellen und nachträglich in Alaunlösung auf- zulösen.^ Man wird auch hier bei den verschiedenen Cliromalaun- hämateinen und Oxyhämatei'neu die zwei Prozesse auseinander zu halten haben (s. oben): 1) die Oxydation des Hämatoxylins, die relativ leicht vor sich geht, und 2) die Lackbildung zwischen dem Hämatein, resp. den Oxyhämateinen und dem Chromsalz. Man arbeite, um dies wahrzunehmen, mit gut gekühlten Lösungen. Nach Zufügen des gelösten Bichromats zur Chromalaunhämatoxylin- lösung (mit oder ohne Schwefelsäurezusatz) beobachtet man zunächst das Auftreten der brauneu Farbe der Hämateine resp. Oxyhämateine. ^) Ganz neulich hat ja auch Paul Mayer sein älteres Verfahren ver- lassen und vollführt die Oxydation des Hämatoxylins in der kalten Alaun- lösung, er gebrauclit jodsaures Natrium als Oxydans ; aber' — was wichtig ist — er verfährt jetzt ebenso, wie ich es 1895 zuerst empfohlen habe, und ge- braucht die quantitativ nötige Menge Oxydans, um das Hämatoxylin in Hämatein überzuführen. Wie ich im Jahre 1895 die berechnete, eben nötige Menge Kaliumpermanganat angab, um 1 g Hämatoxylin in der Alaunlösung in Hämatein zu überführen und die Menge auf das gewöhn- hch vorkoiumende tetragonale Hämatoxylin bezog, ebenso hat P. Mayer jetzt (Zeitschr. f. wiss. Mikrosk. Bd. XX, p. -409 ff.) zwei Qnanta Natrium- jodat angegeben, welche wie die Berechnung zeigt, einfach auf das rhom- bische und das tetragonale Hämatoxylin sich beziehen. Er hat sich also in der Hauptsache meinem vor 10 Jahren angegebenen Prinzip an- geschlossen. 72 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. Erwärmt man, so tritt kurz oder lang, resp. erst beim Kochen die intensiv blaue, schwarzblaue, resp. schwarze Lackbildung ein. Am leichtesten geschieht die Lackbildung beim Hämatein (nur kurzes Kochen , bisweilen schon in der Kälte) ; schon beim Oxyhämatein muß man länger kochen, ehe die Lackbildung beendet ist, und beim Tetra oxy- und Pentaoxy hämatein beobachtet man am deutlichsten die Oxydation getrennt von der Lackbildung. Selbst nach ein paar Minuten Kochen ist wohl die Oxydation des Hämatoxylins,^ aber nicht die Lackbildung erfolgt , die Lösung färbt in diesem Zustande schlecht, in der Eigenfarbe der Oxyhämateine bräunlich, oder schwach schmutzigviolett; erst wenn mau mehrere Minuten kocht, bis die Lackbildung eintritt, erhält man die sattgefärbte Lacklösung. — Die Reaktionsgleichungen, nach welchen die Oxydation mittels Kaliumchromats und Kaliumbichroraats in saurer Lösung ver- läuft, sind der Hauptsache nach die folgenden: Für Kaliumchromat (K^ CrO^ ; Mol. = 194-4): 2 (K, Cr OJ + 5 H, SO^ = 2 K. 80^ + Cr, (SO^). + 5 H^O -f O3. Für Kaliumbichromat (K.^ Cr, 0, ; Mol. = 294*5): K, Cr, 0, -^ 4 H, SO^ = K, SO,, Cr, (SOJ3 -f 4 H,0 -f- O3. Aus diesen Gleichungen berechnet man leicht die per 1 g Häma- toxylin nötige Menge Chromats, resp. Bichromats, um die erwünschten Oxydationsstufen des Hämatoxylins zu erhalten. Wenn die Oxydation in der Chromalaunlösung vor sich geht, liefert diese die notwendige Schwefelsäure, resp. es bilden sich, wie oben angegeben, der Oxydationsmenge entsprechende Mengen basischer Salze. Wünscht man (quantitativ) die Bildung der neutralen Salze, so füge man der Chromalaunlösung vor oder nach der Oxydation des Farbstoffes soviel freie Säure (Schwefelsäure) hinzu, daß sie eben ge- nügt zur (theoretischen) Bildung der neutralen Salze. Wie man aus den Reaktionsgleichungen sieht, braucht Kalium- monochromat 1 Mol. Schwefelsäure mehr (5 Mol.), als das Bichromat ') Vielleicht infolge Ringbildung, Kondensation etc. unter den Oxy- hämateinmolekülen ; über die nicht wenigen, tatsächlich vorhandenen Mög- lichkeiten siehe die chemische Literatur über die Konstitution und den Abbau des Hämatoxylins und des Brasilins. XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 73 (4 Mol.) bei Abgabe gleicher Sauerstoffmengen, d. li. wird keine freie Schwefelsäure hinzugefügt, so bilden sich beim Monochromat entsprechend mehr basische Chromsalze als beim Bichromat. Auf diesen Verhältnissen dürfte es zum Teil beruhen, daß die Anwendung des Monochromates (gelb) bei der alten (R. Heidenhain sehen) Chrom- hämatoxylinstückfärbung bevorzugt wird , während das Bichromat leichter überoxydiert, — der säurebiudenden Wirkung des gebildeten neutralen 2 K., SO^ beim Monochromat nicht zu vergessen. Bei der Chromhämatoxylinstückfärbung nach Apathy sowie bei anderen , wo alkoholische Lösungen angewendet werden, geht im Dunklen und bei Zimnrertemperatur die Oxydation und die Lackbildung (u. a. ent- sprechend der geringen Ionisation) langsamer vor sich und geht auch nicht so leicht zu weit, ist daher besser zu überwachen. Da ich immer quantitativ verfahre, bevorzuge ich aus leicht begreiflichen Gründen das K a li u mb i c h r m a t als x y d a n s. Die Menge freier Schwefelsäure , welche man der Farblösung hinzufügen muß, wenn man das neutrale Chromidsulfat, resp. den Chromalaun als Endprodukt bei der Oxydation mittels Kali um- bi Chromats wünscht, anwenden muß, berechnet sich zu: 1"333 g H2 SO^ pro lg Kaliumbichromat, also braucht 0*276 g^ Kalium bichromat 0-368 g H., SO^ . Die Mengen von Kaliumbichromat, welche nötig sind, um nach dem oben Gesagten 1 g Hämatoxylin in die verschiedenen Oxydations- stufen zu oxydieren, habe ich hier berechnet (und praktisch geprüft). Die Zahlen sind, entsprechend dem praktischen Gebrauche, ein wenig abgerundet, was prinzipiell bedeutungslos ist. Zur Bildung von a) Chromalaun-Hämatein braucht 1 g Hämatoxylin 0"28 g Kaliumbichromat b) „ -Dioxyhämatein ., 1 „ „ 0'55 „ „ c) ., -Trioxyhämatein .. 1 ,, „ 0*69 „ „ d) „ -Tetraoxyhämatei'n ., 1 „ „ 0-83 '„ ,, e) „ -Pentaoxyhämatein ,, 1 „ „ 0*96 ., ,, f) „ -Hexaoxyhämatein ,, 1 „ „ 1-10 „ „ Es lassen sich hiernach eine große Menge von Farblösungen kon- struieren, welche innerhalb ziemlich weiter Grenzen gruppenweise die besprochenen gesetzmäßig abgestuften Farbtöne geben , sowie ent- sprechend dem Gehalt an basischen Chromsalzverbindungeu , resp. ^) Diese Menge genügt, um zwei Wasserstoffatome in 1 g Hämatoxylin zu oxydieren. 74 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. nach dem verschiedenen Säurezusatz beliebig variiert werden können, mit Rücksicht auf Kernfärbung, Plasmafärbung, diffuse Färbung etc., wie ich oben auseinandergesetzt liabe. Ganz entsprechende Varia- tionen lassen sich bezüglich der Farblacke mit anderen Metallsalzen erreichen , wie ich wiederholt hervorgehoben und praktisch vielfach geprüft habe. Die Chromalaunhämateinrezepte, welche ich hier empfehle, sind aus einer großen Menge, praktisch geprüften, ausgewählt, als die mir zweckmäßigst erscheinenden; möge ein anderer nach seinem Ermessen andere Rezepte bevorzugen, das Prinzip einmal aufgestellt wird dadurch nicht verändert. Mein C h r o m a 1 a u n d i o x y h ä m a t e i n hat folgende Zusammen- setzung : 1) Chroma laun (chemisch rein) 10 g, wird gelöst in destil- liertem Wasser 250 g, die Lösung wird gekocht, bis sie ganz grün wird. 2) H ä m a 1 X y 1 i n (pur. krist.) 1 g wird in lieißem destil- liertem Wasser 10 bis 15 g gelöst, die beiden Lösungen werden vermischt , oder es werden die Hämatoxylinkristalle direkt in die heiße Chromalaunlösuug unter Umrühren gelöst. Man läßt die nur schwach gefärbte Lösung erkalten, dann füge man : 3) 0'5 g H2 SO^ (ca. 5 cc einer lOprozentigen Schwefelsäurelösung) hinzu und hernach 4) oxydiert man. Kali u m b i c h r m a t 0*55 g wird in ca. 20 cc warmem Wasser gelöst, und nachdem diese Lösung auch abgekühlt (durch Eintauchen des Reagensglases im Wasser), gießt man sie tropfenweise unter stetem Umrühren in die Chrom- a 1 a u n h ä m a t o x y 1 i n 1 ö s u n g. Man erwärmt die Mischung bis zum Kochen und läßt unter stetem Umrühren einige Minuten lang sieden, bis die Lackbildung vollendet ist, was oft nur 1 bis 2 Minuten dauert. Durch den Schwefelsäurezusatz hält sich der Lack fast ganz in Lösung , ein geringer ungelöster Überschuß des Lackes schadet durchaus nicht, ist eher erwünscht. Vor dem Gebrauche wird immer filtriert. Die Lösung liält sich sehr lange. Schnitte werden damit ^/^ bis 2 bis 5 Minuten XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 75 und länger gefärbt ; o h u e daß lu a n d a Über f ä r b e n zu f ü r e li - ten braucht, kann mau stundenlang färben. Bei mäßiger Erwär- mung (40 bis 50 ^) färbt sie auch noch schneller. Ich färbe ent- weder ö bis 10 Minuten, erwärme gelegentlich kurz, ich habe nie einen Nachteil von der Erwärmung gesehen. Die Farbe ist eine tief blauschwarze, äußerst präzise und scharfe K e r n f ä r b u n g (Chromatin) , auch das Plasma färbt sich schwach , aber bei der angegebenen Zusammen- setzung ist die Kernfärbung dominierend.^ Die Farbe ist gegen Säuren etc. äußerst widerstandsfähig und hält sich auch im Lichte vorzüglich. Sie läßt sich mit bestem Erfolge mit Säurefuchsin- Pikrinfärbung verwenden, sowie mit den roten und orangen Plasma- farben etc. Indem der Chromalaun die Gewebe verschieden stark beizt, werden die Gegenfärbuugen oft feiner abgestuft in ihren Tönen er- scheinen, als bei der Tonerde-Häraatoxylinfärbung. Ich empfehle diese Farbe und die folgenden als besser als Tonerdealaunhämatein für den gewöhn- lichen Gebrauch,^ weil eben die Chromoxyhämateine sehr echte Farben sind. Für die M i k r p h 1 o g- r a p h i e haben sich diese Chromalaun- hämateine , ebenso wie meine Eisenhämateinfärbung , sehr geeignet erwiesen. Die Farbeverteilung ist so bestimmt , daß ich dieses saure Chromalaunhämatein unverändert als Stückfärbung habe benutzen können. Man färbt dann bei kleinen Stücken 3 bis 4 bis 5 Tage laug- (bei größeren länger), wäscht gut in destilliertem Wasser aus, welches oft gewechselt und am besten vorher durch Auskochen von Sauerstotf befreit wird,'^ ebenso wie man das Glas ganz vollfüllt l)is an den Stöpsel. Das Auswaschen dauert am besten nicht zu kurz {',> bis 4 bis 5 Tage), aber selbst wenn das Wasser sich noch ganz schwach färbt, kann man ruhig mit Alkohol in steigender Konzentrierung weitergehen und dann einschmelzen. Die Stückfärbung ist ebenso vorwiegend Kernfärbung, aber auch Plasma , Bindegewebe , Muskeln etc. haben einen schönen Ton er- ^) Der Schlehn wird in der wässerigen Lösung oft metachromatisch rotviolett gefärbt, jedoch hält sich diese Metachromasie nicht in Alkohol. ^) Die Strukturen vertragen infolge der schwärzeren Farbe weit stärkere Vergrößerungen als beim Tonerdehämatem. ^) Kann in vielen Fällen unterbleiben. 76 Hansen: Über Hämate'inlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1, halten. Die glatten Muskeln färben sich gewöhnlich etwas grauer im Ton. Durch vermehrten Schwefelsäuregehalt (z. B. 0*6 bis 0*7 g) läßt sich reine Kernfärbung erzielen , doch das muß je nach dem Mate- rial ausprobiert werden , gewöhnlich ziehe ich etwas Plasmafärbung mit vor. * * Ist stärkere Plasmafärbung erwünscht, als die angegebene Farb- lösung gibt, so nehme man einfach O'IO bis 0*25 bis O'BO g Schwefelsäure statt 0*50 g. Ohne Schwefelsäurezusatz färbt die Farblösung Kerne sehr intensiv, dann aber auch Plasma, Strukturen, Muskeln,^ Zwischen- substanzen etc. stark, aber sehr „difterenziert", nur muß die Färbe- dauer sich etwas nach dem Material, der Fixation u. dergl. richten; gewöhnlich darf die Färbung nicht zu lange dauern, weil sie sonst zu intensiv wird. Das beste läßt sich doch sehr leicht ausprobieren. Für gewöhnlich verwende ich zwei Lösungen, mit resp. 0*25 g und 0*50 g Schwefelsäure, sowie eine Lösung ohne Schwefelsäure. Geht mau von der schwefelsauren , rein kernfärbenden Lösung aus, so ist dieselbe aber sehr leicht in eine sicher plasmafärbende zu verwandeln, man braucht nur die Farblösung mit ein wenig am besten frisch gefälltemChromoxydhydrat(Cr(OH)3) zu versetzen, gut schütteln, eventuell etwas zu erwärmen (nicht kochen!) und dann zu iiltrieren. Auch mit entsprechend geringem Alkalizusatz bewirkt man dasselbe, und kann man sich so leicht die zur Neutralisation des Schwefel- säurezusatzes nötige Menge einer dünnen kohlensauren Alkalilösung berechnen und einem beliebigen Quantum der Farblösung zusetzen."-^ Mit dem Tetraoxyhämatein bis dem Hexaoxyhämatein liefert der Chromalaun ja schwarze Färbungen. Wünsclit man solche , so ver- wende man einfach: 250 g Wasser, 12 g Chromalaun, 1 g Häma- toxylin und (statt 0*55 g) 0*83 g Bichromas kalicus, man erhält so das Tetraoxyhämatein, welches ich als das zweckmäßigste be- trachte, oder man verwende 0*96 g Bichromas kalicus, womit man Pentaoxyhämatein bekommt. Der Schwefelsäurezusatz sei dann ^) Man beachte die starke Färbung der glatten Muskeltibrillen, sowie die Membranellen vom Bindegewebe um die glatten Miiskelzellen etc. '-) Durch Zusatz von kohlensaurem Alkali zur Tonerdehämateinlösung (Alaunhämatoxylin) habe ich die gewöhnliche Lösung in eine stark schleim- färbende verwandeln können (darüber werde ich später berichten). XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 7 7 uiclit größer als 0'3 bis 0*4 g, weil die Färbekraft der höheren Oxydationsprodukte geringer ist. Man koche energisch, bis sich die intensiv schwarzvioletten Lacke bilden, denn anfangs erhält man nur die braune Färbung des Oxyhämateins. Ein Bodensatz schadet nicht; vor dem Gebrauche wird filtriert. Die Färbung ist eine Schnittfär- bung, am besten mit Erwärmung, wie früher gesagt. Auch als Stlickfarben lassen sich die Lösungen verwenden, man setze aber dann etwas mehr Schwefelsäure hinzu, je nach dem Ma- terial; doch verfüge ich in dieser Beziehung nur über beschränkte Erfahrung. Dagegen kann man mit Chromalaundioxyhämatein^ als Ausgangs- punkt sehr leicht schwarze Schnittfärbuugen extemporieren. Man ver- mische am besten 10 Teile der Färbelösung mit 1 Teil einprozeutiger Bichromaskalicuslösung" in der Kälte und färbe z. B. unter mittlerer Erwärmung. Alsdann bekommt man rein schwarze Kernfärbungen; auch an- dere Verhältnisse der Mischung lassen sich brauchen, nimmt man aber wesentlich mehr Bichromat, wird die Farbe nicht so intensiv und auch bräunlicher im Ton; bei entsprechender Variation der Mischungsverhältnisse lassen sich alle Töne von blauschwarz, schwarz bis zu braungelb und gelblich erzielen. (Die verschiedenen Mißfär- bungen, welche gelegentlich bei der R. Heidenhain sehen Chromhäma- toxylin-Stückfärbuug eintreten, erklären sich aus dem hier Mitgeteilten, ebenfalls, daß die Beizung der Gewebe gelegentlich geringer ausfällt, indem die Reduktion in Chromidverbindungen ungenügend vor sich geht.) Beizt man beliebig fixiertes Material mit einer Chromalaunlösung, und behandelt man hernach die Stücke mit einer Lösung von Häma- tein oder besser Dioxyhämatein , so erzielt man seTir gute Stückfär- bungen; auch für Schnitte zu verwenden. Die Fixierung des Chromoxyds (aus dem Chromalaun) auf den Geweben läßt sich sehr augenfällig so demonstrieren. Man beizt drei Stücke desselben Materials (z. B. in Alkohol oder Formolalkohol fixiertes) in 1) Mit 0-5 g Schwefelsäure. ^) Auch einprozentige Chromaskalicuslösung läßt sich in der Kälte verwenden. 78 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. a) 5 Prozent ueutr. Chromalaun in Wasser (grün gekocht); b) in derselben Lösung mit 1 bis 2 Prozent Hg SO^ Zusatz; c) in einer Lösung, in welcher durch Zusatz von einigen Tropfen konz. (25 Prozent) Ammoniak oder 10 Prozent Nag CO3 ein Mehrgehalt an löslichen basischen Salzen gebildet sind (siehe oben).-^ Am besten beizt man bei Brütofentemperatur (30 bis 35 ^ C.) ein paar Tage; die Lösungen dringen sehr gut ein, und dann sind die Stücke, welche in der neutralen (a) und der basischen (c) Lösung behandelt worden sind, ganz grün, graugrün; die in der sauren Lösung (b) dagegen sehr wenig resp. gar nicht graugrün. Durch diese Mittel, Schwefelsäurezusatz oder Alkalizusatz, hat man es in seiner Hand, die Litensität der Beizung zu variieren, je nach dem Material, natür- lich auch durch die Dauer und die Temperatur. Mit der basischen Beizung erhält man außer Kernfärbung mehr diffuse Färbung, welche sich besonders für dünne Schnitte und Plasma- strukturen eignen. Nach derBeizuug, durchweiche unlösliche Chromoxydverbindungen (conf. oben) auf dem Gewebe befestigt worden sind, wird abgespült oder auch ausgewaschen (ist nicht so sehr von Belang) und hernach werden die Stücke (bei 30 bis 35 Grad) in dem 10 fachen Volum von 0*5 Prozent Dioxyhämatein- in Wasser oder auch mit 25 bis 50 Prozent Alkoholzusatz einige Tage (2 bis 5) gefärbt, je nach der Größe der Stücke. Es bilden sich gewöhnlich keine Niederschläge, die Farbflüssig- keit wird nötigenfalls einmal erneuert , und jetzt bildet sich im Ge- webe der tief schwarzblaue Lack , natürlich nur an den Stellen ge- bunden, wo die Beize gebunden war, während die Farbflüssigkeit zwar dunkler gefärbt, aber klar bleibt. ^) Z. B. 5 bis 10 Tropfen Ammoniak auf 250 g 5prozentiger grüner Chromalaunlösung; der entstehende Niederschlag muß sich in der kalten Lösung glatt wieder auflösen beim Schütteln ; die Lösungen müssen sich auch nach dem Kochen klar halten. ^) 1 g Hämatoxylin wird in 150 g Wasser gelöst, es werden 0-31 g H., SO4 zugefügt; dann löst man 0"355 g Kaliumpermanganat in 50 g Wasser und vermische die kalten Lösungen. Man erwärmt, kocht ein paar Mi- nuten und erhält eine tief braune Lösung von Dioxyhämatein, welche sich sehr gut hält. Man kann das Hämatoxylin in entsprechend weniger Wasser lösen und nach der Oxydation mit der entsprechenden Alkoholmenge ver- mischen, z. B. 1 g Hämatoxylin in 50 g Wasser oxydieren, dann 50 g Alkohol zugefügt. XXII, 1. Ilunsen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 79 Nach passendem Auswaschen in destilliertem Wasser überführe man in Alkoliol in steigender Konzentration, und da das Hämatein oder Dioxyhämatein in Alkohol etwas löslich ist, braucht man Nieder- schläge in den Stücken niclit zu fürchten ; Paraftineinbettung oder Celloidin. Gewöhnlich habe ich so verfahren : Beizung in grüner Chromalaunlösung bei 30 bis 35*' 2 bis 5 Tage, Auswaschung eventuell '^j.-^ bis 1 Tag; Färbung in 0'5pro- zentigen Dioxyhämatein ebenso lange. Nur bei sehr schwierigem Material bilde ich in der Beizflüssig- keit ein wenig basische Salze. Bei passendem Schwefelsäuregehalt der Beizflüssigkeit, 1 bis 2 pro Mille, erhält man mehr reine Kernfärbung. Vergleichsweise habe ich auch eine Manganhämatein- 1 ö s u n g versucht ; am besten verwendet man hier auch Dioxyhäma- tein. Mit einer starken Lösung von Manganosulfat (MnSO^) bildet eine einprozentige Lösung von Dioxyhämatein einen violettbraunen Lack , welcher in der Wärme dissoziiert wird ; in einer verdünnten Lösung von Manganosulfat tritt die Lackbildung nicht ein. Das Mauganhämatein wird folgendermaßen bereitet: Manganosulfat 5 g, destilliertes Wasser 200 g, Hämatoxylin 1 g werden gelöst. Man oxydiert mit Kaliumpermanganat 0"18 bis 0"19 g in 10 cc Wasser gelöst. Wünscht man Mangandioxy- hämatein, so verwende man einfach 0*36 g Kaliumpermanganat. — Beim Kochen erhält man erst einen intensiv schwarzvioletten Niederschlag und eine braune Lösung; setzt man aber eine ganz geringe Schwefelsäuremenge hinzu (1 bis r2 cc einer lOprozentigen Ho SO^- Lösung -\- 200 g Farblösung), so ist der Niederschlag darin außerordentlich leicht löslich, und man erhält eine tief orangebraune Lösung, welche schön tiefbraune Kerne, braunes Plasma (auch braune Centrosomen) färbt. Anwendung ganz wie bei einer Alaunhämatein- lösung. in. Betreuend der gewöhnlichen Tonerdealaunhämateinlösung habe ich gefunden, daß man, wenn man das von mir 1895^ an- ^) Zool. Anz. No. 473. 80 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösimgen. XXII, 1. gegebene quantitative Vorgehen bei der Herstellung des volloxydierten „Alaunh.äraatoxylins" befolgt, man durchaus nicht ängstlich zu sein braucht, etwas zu hoch zu oxydieren, wenn man nur das Dioxy- hämatein nicht überschreitet , auch muß genügend Alaun vorhanden sein. Eine passende kleine Menge Schwefelsäure dazu mit Rück- sicht auf das zu bildende neutrale Manganosulfat bewirkt, wenn ge- wünscht, reinere Kernfärbung. Um neutrales Manganosulfat bei der Oxydation mit Kaliumpermanganat in der Alaunlösung zu bilden, braucht 1 g Kaliumpermanganat 0*93 g Schwefelsäure; die pro 1 g Hämatoxylin zur Überführung in Hämatein nötige Menge (0'177 g) Kaliumpermanganat braucht also 0*157 g H, SO^. Eine Tonerde- alaunhämateinlösung nach meinen Angaben im Jahre 1895 (Zool. Anz. No. 473) läßt sich jetzt auch so zusammensetzen, indem ich nur den geringen und praktisch bedeutungslosen Alkoholgehalt weg- gelassen habe. a) 20 g Kalialaun gelöst in 200 g destilliertem Wasser in der Wärme. — lg Hämatoxylin wird ebenso in der warmen Alaunlösung leicht aufgelöst, eventuell durch Kochen. Man oxydiere mit einem der vielen geeigneten SauerstofFsiJender, am besten, wie ich es empfohlen habe, b) mit (0*177) 0*18 g Kaliumpermanganat,^ welches in einer kleinen Menge Wasser gelöst wird. Indem a und b kalt vermischt werden, beginnt sogleich die Hämateinbildung und die Lackbildung. Ich erhitze aber die Mischung zum Kochen, weil so die Hämateinbildung und die Lack- bildung in kürzester Zeit beendet wird ; in der Kälte dauert es etwas länger, bis der Prozeß abgelaufen ist. Viele Histiologen arbeiten, um reine Kernfärbung zu er- halten, mit Vorliebe mit einer dünneren Tonerdealauuhämateinlösung, wie mit dem P. MAYERSchen Hämalaun. Eine dem Hämalaun in allen den Eigenschaften, worauf es ankommt, ähnliche Hämateinalaunlösung stellt man sich aus meinem Tonerdealaunhämatein leicht dar durch einfache Verdünnung mit Alaunwasser. Man nehme einfach 220 g meiner Lösung,'-^ dem neuen oder dem alten Rezepte nach, und ^) 3 CO einer bei 16*^ konzentrierter wässeriger Lösung von Kalium- permanganat, wie ich seinerzeit für die Praxis angab, entspricht mit ge- nügender Genauigkeit dem hier angegebenen Quantum. -) Ob dieselbe die 10 cc Alkoliol, welche früher zur Auflösung des Hämatoxylins gebraucht wurden, enthält oder nicht, ist praktisch ganz be- deutungslos; ebenso ist der Manganosulfatgehalt ganz gleichgültig, von XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen, g 1 vermische sie mit 800 g Wasser und 30 g Alaun. Das Re- sultat ist, wie leicht ersichtlicli, „Hämalaun". IV. Ein paar einfache Methoden zur Darstellung von Häraatein- lösungen dürften hier angezeigt sein. A. Wässerige Hämateinlösung. 1) 1 g Hämatoxylin (pur.) wird in der Wärme in .50 g destil- liertem Wasser gelöst, dazu O'lö? g HgSO^^ (0-16 g). 2) 0-177 g (0-18) Kaliumpermanganat in .50 g destilliertem Wasser gelöst. 1 und 2 werden vermischt (kalt), die Reaktion beginnt sogleich. Man erwärmt kurz zum Kochen , und läßt nach der sehr schnellen Beendigung der Reaktion wieder erkalten, indem man das Gefäß in kaltes Wasser stellt. Man hat alsdann eine dunkel orangebraune Lösung von Häma- tein erhalten, welche sich fortwährend fast klar hält. Ein ganz ge- ringfügiger Niederschlag mit der Zeit schadet nicht, wird aber auch teils durch beliebigen Alkoholzusatz, teils durch Verdünnung bis auf ^/^ Prozent vermindert. Die geringen Spuren von Kaliumsulfat und Manganosulfat sind praktisch ohne jede Bedeutung für unsere Zwecke. keinerlei Einfluß auf die Farbe. Es ist eine theoretische Prüderei, an dem gebildeten Manganosulfat Anstoß zu nehmen und nicht auch den verwendeten Kalialaun auf Verunreinigungen zuerst chemisch zu unter- suchen, was gewiß kein Mikrotechniker tut. Die Methode von Harris (1898), statt Kaliumpermanganat Quecksilberoxyd zur Oxydation des Häma- toxylins in der warmen Alaunlösung zu verwenden, ist von autoritativer Seite als „theoretisch richtiger" als die meinige (1895) bezeichnet worden, wahrscheinlich hat man erstens nicht kontrolliert, ob die Reaktion auch quantitativ verläuft, wie wir dies beim Kaliumpermanganat z. B. wissen, zweitens ist auch die Richtigkeit nur eine „theoretische", denn praktisch enthält die Hämateinalaunlösung nach dem Kochen mit Quecksilberoxyd aufgelüste Quecksilbersalze, wie leicht nachweisbar; vielleicht rührt die „bessere Haltbarkeit" der Harris sehen Lösung (Zeitschr. f. wiss. Mikrosk. 1901) gegenül>er der Mayer sehen Lösung nicht vom Klima, sondern von dieser praktisch sonst gewiß unwichtigen Verunreinigung mit Quecksilbersulfat lier. Natürlich haben all diese ganz kleinen Mengen von Nebenprodukten ebensowenig zu bedeuten wie das Jodnatrium in Paul Mayers neuestem Hämalaun. ^j Man scheue die kleine Mühe nicht, diese Menge titrimetriscli bei- zufügen, wenn man ganz genau arbeiten will. Zeitschr. f. wiss. :Mikroskopie. XXII, 1. (j 82 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. Ein Alkoliolzusatz , z. B. von 10 bis 25 Prozent, kann empfohlen werden. Nach ganz derselben Methode lassen sich beliebig hochoxydierte Oxyhämateinlösuugeu darstellen (s. oben). Eine Dioxyhämätein- lösung vQu ^/g Prozent habe ich mehrmals mit gutem Erfolge verwendet. 1 g Hämatoxylin in 150 g Wasser gelöst, dazu 0'32-^ g Ho SO^ wird mit 0'36'- g Kaliumpermanganat in 50 g Wasser gelöst, oxydiert ; man erhält eine tief braunrote Lösung ; eventuell Alkohol- ersatz eines Teiles des Wassers. Ich habe im vorhergehenden die Oxydationsprodukte des Häma- teius rein praktisch als Di-, Tri-, Tetra- etc. Oxyhämateine benannt und, wie gesagt, vorläufig ganz willkürlich die Sache so betrachtet, als ob 2 bis 6 Wasser stoifatome des Hämateins oxydiert würden, indem die 1 bis 3 Sauerstoffatome verbraucht würden, gleichviel ob wirklich 2 Wasserstoffatome als Wasser wegoxydiert würden (wie das bei der Hämateinbildung aus dem Hämatoxylin geschieht), oder ob vielleicht Hydroxylierung eines Wasserstoffatoms durch Einführung des Sauerstoflatoms erfolgte. Sobald wir nämlich über das Häma- tein hinausgehen , wußten wir , bisher wenigstens , nichts genaueres über die Natur und Konstitution der Oxydationsprodukte anzu- geben. In den letzten Jahren sind wir aber durch die Arbeiten von Perkin und Yates,'^ welche mir nicht zugänglich waren, und durch die Arbeiten von St. v. Kostanecki und Lampe , sowie von BoLEiNA, V. KosTANECKi uud J. Tambor u. a. Über die Konstitution und den Abbau des Brasilins und des mit demselben so eng ver- wandten Hämatoxylins sehr viel genauer unterrichtet worden. Wer die hierher gehörige fachchemische Literatur studiert, wird an der Hand der da angegebenen Daten leicht sehen , daß es mehrere tatsächlich vorhandene Möglichkeiten zum Unterbringen , resp. zum Verbrauche von 3 (und auch mehr) Sauerstoffatomen gibt, wie ich es oben angenommen hatte. Sei es nun Hydroxylierung oder Weg- oxydation von Wasserstoff", eventuell mit Doppelbindung oder Ring- schließung, sowie auch Kondensation oder Verkettung von zwei oder 1) Eigentlich 0-314. 2) Eigentlich 0-355 g. *) Proced. ehem. Soc. vol. XVI, 1900. XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 83 mehreren Farbstoffmolekülen, mit oder ohne Beteiligung- von Metallsalz- molekülen. Was speziell die höheren Oxydationsprodukte betrifft, würde es mich nicht überraschen, wenn Ringbildung oder Verkettung von mehreren Farbstoffmolekülen gefunden werden sollte. Die eigentümlich verlangsamte Lackbildung , welche besonders bei Farbstofflösungen auftritt, welche einige Zeit (ohne Nachoxyda- tion) gestanden hatten, könnte auf eine also temporär verminderte Reaktionsfähigkeit hindeuten. Ebenso ist die Möglichkeit der Kon- densation bei der Lackbildung in der Lösung und insbesondere bei der Fixierung des Farblackes in den Geweben zu denken ; auch das mit der Zeit selbst in ganz gefüllten , wohl verschlossenen (aus- gedampften) Flaschen auftretende Unlöslichwerden eines Teiles des Farblackes ^ könnte dafür sprechen. Besonders mache ich auf das Phänomen aufmerksam, daß alle Chromalaunhämatein- und Oxyhäma- teinlacke in der Lösung blauviolett , resp. tiefblau erscheinen , im Gewebe fixiert vielfach ganz schwarz färben. Weiter sich in Vermutungen zu ergehen, hat vorläufig (für mich) keinen Zweck; der Möglichkeiten sind eben viele. Eine Diskussion an der Hand der Konstitutionsformeln hat imr Wert für das Auf- suchen von Direktiven für eine genaue quantitative chemische Unter- suchung der besprochenen Verhältnisse. Von großem Wert wäre jedenfalls die Elementaranalyse, u. a. die Bestimmung der Anzahl Metallatome in den Farblacken der Eisen- und Chromverbindungen im Verhältnis zur Anzahl der Hämatoxylin- resp. Hämatei'nmoleküle. Man bekäme dann etwas festeren Boden unter den Füßen für theore- tische Deduktionen. Es ist natürlich sehr wohl möglich , daß schon in der technischen Literatur derartige, mir nicht auffindbare Angaben vorliegen, in der mir zugänglichen chemischen Literatur habe ich solche nicht gefunden, auch wird ja selbst in den speziell farbchemi- schen Lehrbüchern aus der neuesten Zeit angegeben, daß die höheren Oxydationsprodukte des Hämatoxylins nicht genau untersucht wor- den sind. Es ist für einen Chemiker selbstverständlich, daß das meiste des hier Mitgeteilten nicht bloß auf das Hämatoxylin und dessen Oxydationsprodukte, sondern auch auf das so eng und gleichartig konstituierte Brasilin und dessen Oxyderivate angewendet werden kann , wie mir auch einige hierher gehörige Versuche bestätigt haben. Wh-d durch die Ansäuerung (Salzbildung) verhindert. 84 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. Durchgehend aber sind die Hämatoxylinfarben den Brasilinfarben für mikroskopische Zwecke vorzuziehen, u. a. weil die Hämatoxyline mehr blau resp. blauschwarz sind, und daher optisch den mehr roten Brasilinderivaten vorzuziehen sind. Durch Berücksichtigung der Diffe- renz im Molekulargewicht (und der Anzahl der Hydroxylgruppen) lassen sich sehr leicht die oben angegebenen Rezepte auf das Bra- silin und Brasilein umrechnen. Es war (und ist noch) meine Absicht , die methylierten Hämatoxyline auf ihr färberisches und lackbildendes Vermögen zu untersuchen , weil ich aber zu spät die dazu nötigen Materialien bekommen habe, muß ich diese Versuche von der vorliegenden Publi- kation ausschließen. Für die Ausarbeitung der in dieser Arbeit mitgeteilten Unter- suchungen habe ich , soweit möglich, die wichtigsten fachchemischen Originalarbeiten über das Hämatoxylin studiert und den größten Nutzen, wenigstens für meine eigene Auffassung der hierhergehörigen Verhältnisse, davon gehabt. Hatte ich doch selbst vor Jahren das Hämatoxylin sowie das Hämatein und dessen Farblacke zuerst aus den chemischen Lehrbüchern kennen gelernt, und ist doch die Dar- stellung des Hämateins und des Hämateinammoniaks schon im Jahre 1842 von 0. L. Erdmamn so sorgfältig beschrieben worden, wie noch nicht in der histologisch-mikrotechnischen Literatur, so da:ß Erdmanns Methode der Darstellung^ seitdem in den größeren chemischen Hand- büchern steht, von den späteren Origiualabhandlungen nicht zu reden. V. Über Ferricochenillelösung. Daß Cochenille mit Eisenverbindungen graue resp. schwarze Farbtöne gibt , ist den Färbern ja längst bekannt , daher auch die Warnung vor eisenhaltigem Wasser bei der Cochenillefärberei. In der Mikrotechnik sind diese schwarzen Cochenilleeisenlacke von A. Spuler '^ verwertet, welcher besonders eine Stückfärbung in zwei Stufen an- ^) Oxydation einer ammoniakalischen Hämatoxylinlösung an dem Luftsauerstoif in einer flachen Schale. -) Enzyklopädie der mikroskopischen Technik. I. Artikel Coche- nille (1903), p. 153—154. XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösung-en und Cochenillefarblösungen. 85 gegeben hat , indem erst mit einem Cochenilleauszug durchgefärbt und dann in Eiseualauulösung gebeizt und umgefärbt wird. Auch für Schnitte läßt sich diese Methode natürlich verwenden. Später hat K. Peter^ eine abgeänderte Spui.ERSche Methode benutzt, um bei sonst schwarzer Farbe der Kerne etc. die Dotterkörner rot- gefärbt zu erhalten. Nun habe ich nach Analogie der von mir oben beschriebenen Eisenalaunhämateinlösung und Chromalaunhämatei'nlösung ein paar Farblösungeu hergestellt, welche ich u. a. des theoretischen Ver- gleiches wegen neben der Hämateinfärbung besprechen werde. Wässeriger Cochenilleauszug gibt bekanntlich mit Eisenchlorid sowie mit Eisenalaun schwarze Fällungen. In Säuren lösen sich diese schwarzen Ausfällungen wieder auf. Es läßt sich nun ziemlich leicht eine Ferricochenille- lösung ausprobieren, welche Kerne intensiv schwarz färbt, ebenso, aber schwächer, die übrigen Bestandteile in schwarzer bis grauer Farbe. Ich benutze seit längerer Zeit mit Erfolg unten beschriebene Lösung: Ferriammonium Sulfat (Eisenalaun) 8 g wird aufgelöst in destill. Wasser 250 g, Cochenillepulver 5 bis 10 g wird darin sorgfältig verteilt (es färbt sich die Cochenille sogleich ganz schwarz), und 15 cc einer lOprozentigen Schwefelsäurelösung werden zugesetzt; man erhitze unter Umrühren zum Kochen und lasse cirka 15 bis 20 Minuten sieden, indem man das abgedampfte Wasser von Zeit zu Zeit ersetzt; nach 10 Minuten Kochen werden wieder 10 cc der lOprozentigen Schwefelsäure zugesetzt, so daß im ganzen 25 cc lOprozentige Schwefelsäure zugefügt worden sind. Die Farblösung wird abfiltriert und soll ganz dunkelbraun bis schwarzbraun sein. Die Lösung ist sehr haltbar. Man färbt Schnitte aus beliebigem Material darin 5 bis 10 Mi- nuten, eventuell mit Erwärmung der Lösung; spült ab mit destil- liertem Wasser, gewöhnliches Leitungswasser kann nach Belieben zur Nachbehandlung verwendet werden, die Farbe wird dadurch vielleicht etwas besser fixiert. Gewöhnlich braucht man nicht zu differenzieren , aber in ver- dünnten Säuren (2- bis 4prozentige Essigsäure langsam oder 1 bis 2 bis 1) Zeitschr. f. wiss. Mikrosk. Bd. XXI, 1904, p. 314—320 (Eine neue Dotterfärbung), Jan. 1905. 86 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. öpromillige Schwefelsäure schneller) erzielt man jeden beliebigen Grad von Kernfärbung. Auch als Stückfärbung läßt sie sich sehr gut verwenden. Man färbt alsdann 3 bis 4 bis 5 Tage (oder länger) in der Lösung; Auswaschung in destilliertem Wasser, dann Härten in Alkohol steigen- der Konzentration etc. Vorzugsweise sind die Kerne ganz schwarz gefärbt, aber auch Plasma und die übrigen Gewebsbestandteile haben feine graue Töne erhalten; so stark plasmafärbend wie Eisenhäma- tein ist sie lange nicht, deswegen eignet sie sich besonders für Stück- färbung. Das Eisensalz muß eine Fe r riverbin düng sein;^ dies läßt sich leicht demonstrieren. Kocht man z. B. Cochenillelösung mit einer Lösung von Ferro- ammoniumsulfat, welcher sicher keine Ferriverbindungen enthält, so bekommt man nur purpurrote Farbe der Mischung; sehr ähnlich der Alauncochenille unter sicherem Ausschluß von Sauerstoif färbt diese Ferrocochenillelösung ganz purpurrot, analog einer Alauneoche- nille , läßt man aber die also roten Sclmitte in sauerstoffhaltigem Wasser liegen, so changiert die Farbe nach und nach in grau bis schwarz (Kerne). Erst werden die Kerne schwarz , dann folgt das Plasma, während das Bindegewebe sich etwas länger rot hält. Wird eine Spur von oxydierender Substanz in die Lösung ge- bracht, so tritt mit dem Ferrisalz sogleich die graue bis schwarze Färbung ein. Auch der umgekehrte Versuch läßt sich machen. Tropft man eine Iprozentige Oxalsäurelösung zu der schwarzbraunen Ferricoche- nillelösung (warm), so verwandelt sich nach und nach das Ferrisalz in Ferrosalz; sobald diese Umwandlung vollständig ist, ^ ist die Flüssigkeit jetzt ganz rotfarbig geworden und färbt die Schnitte (aus sauerstoif freiem Wasser) auch rot, wie oben beschrieben; bei Gegenwart von sauerstoffhaltigem Wasser geht die Farbe wieder in schwarz über. Oxydationsmittel verwandeln natürlich die also durch Oxalsäure reduzierte rote Ferrocochenille wieder in schwarze Ferricocheuille. Dieser Versuch läßt sich vielfach variieren. Vermischt man ausgekochte Alaun ■' cochenillelösung mit gleichen ^) Im Gegensatz zum Eisenhämatein. ■-) Ein kleiner Überschuß an Oxalsäure ist vorteilhaft um die Luft- oxydation zu neutralisieren. ■') Tonerdealaun. XXII, 1. Hansen: Über Hiimateinlösungen und Cochenillefarblösungen. 87 Teilen einer gleicbprozeutigen, sicher ferrisalzfreien Lösung von Eisen- sulfat ^ (oder MoHRS Salz), so färben sich bei Sauerstoffausschluß die Schnitte nur rot oder purpurn, wie bei der Alauncochenille üblich, beim geringsten Zusatz^ aber von oxydierender Substanz (z. B. Gegenwart von Chromaten oder Chromichromat) wird die Färbung aber gleich schwärzlich, — hier zuerst das Plasma, während sich die Kerne länger rotviolett halten. Letzteres Verhalten beruht natürlich darauf, daß sich der violette oder purpurne Tonerdecochenillelack in die Kerne lokalisiert hat, und daß er erst nachträglich durch den Ferrilack ver- drängt werden soll; in dem zuerst erwähnten Versuche, wo nur Eisenbeize vorhanden war, müßten natürlich die Kerne ihrer Affinität entsprechend zuerst die Ferrisalze aufspeichern und so zuerst und am stärksten schwarz werden.'^ Es ist für das Gelingen dieser Ver- suche notwendig, unter peinlichstem Ausschluß des Sauerstoffs von den Ferroverbindungen zu arbeiten. VI. Chromalauncochenille. Eine ziemlich gut verwendbare Chromalauncochenille läßt- sich leicht herstellen: ö Chromalaun o g Destilliertes Wasser 200 „ Cochenille 10 ,, werden 15 bis 20 Minuten gekocht, indem das abgedampfte Wasser immer ersetzt wird, eventuell kann etwas (5 cc lOprozentige H., SO^) zugefügt werden. Man erhält nach der Filtrierung eine dunkelgraublaue Lösung, welche Kerne tief graublau färbt , während das Plasma sich mehr ^) Eventuell mit einem ganz kleinen Oxalsäuregehalt. '^) Die gewöhnlichen wässerigen Lösungen von Eisenoxydulsalzen ent- halten ja immer etwas Ferrisalz, ohne besondere Vorsichtsmaßregeln würde also auch gewöhnliche Eisensulfatlösung die roten Cochenillefarben schwarz färben. ^) Ganz analog dem hier Gesagten erklärt sich also Peteks Kot- bleiben der Dotterkörner beim schwarzen Färben der Kerne. Der wässe- rige Cochenilleauszug ist wahrscheinhch in den Dotterkörnern stärker gebunden als in den (nicht gebeizten) Kernen; kommt jetzt Eisenalaun- lösung hinzu, so findet die Lackbildung in den Kernen und also auch die Umlarbung viel leichter statt als in den Dotterkörnern , deren Affinitäten schon besser durch die Cochenille abgesättigt waren. 88 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXII, 1. grau färbt. Besonders für Dur clif ä rbuug eignet sich diese Farb- lösuug sehr gut; sie ist vorwiegend kernfärbend. Schnitte färbe man entweder stundenlang oder erwärme die Farblösung; wünscht man stärker diftuse Färbung, setze man 2 g Kaliumacetat hinzu und koche die Lösung, oder man füge dem jedesmal zu gebrauchenden Quantum ein wenig Ammoniak hinzu, 5 bis 8 Tropfen einer 25prozentigen Ammo- niaklösung auf 200 cc Farblösung genügen, aber durch etwas Thymol- zusatz muß man alsdann diese ammoniakhaltige Lösung vor Schimmel- bildung schützen. Schnitte in der Chromalauncochenillelösung gefärbt werden mit ^1^ pro Mille Bichromaskalicuslösung behandelt schwarz. 2 pro Mille Ur annitratlösung bewirkt ebenso erst schwarze, her- nach grünschwarze bis dunkelgrüne Farbe der Schnitte. Übrigens glaube ich nicht, daß diese Farblösung je besondere praktische Be- deutung erlangen wird, weil wir andere bessere Lösungen besitzen; ich habe sie auch nur deswegen erwähnt, weil sie für die Chrom- cochenillelackbildung interessant ist. Der Chromidcochenillelack bildet sich nämlich nur leicht beim Kochen der Chromalaunlösung mit dem Cochenillepulver, bei niedri- gerer (also auch gewöhnlicher) Temperatur bekommt man eine schar- lachrote Lösung der Cochenille in Chromalaunlösung, welche die Kerne rot färbt, auch die roten Blutkörperchen stark etc.; erst beim Er- hitzen der Schnitte in der Farblösung bis zum Kochen^ sieht man die rote Farbe in dunkelgraublaue umschlagen, ganz wie im Ton der gebildeten Chromidcochenillelacke. Nun ist es bekannt, daß man gelegentlich bei Alauncochenille- stückfärbung von Material , welches in Chromaten fixiert wurde , oft z. B. die glatte Muskulatur (auch Schleim ab und zu) mit violettroten Kernen und graublauem Plasma gefärbt erhält, daß also eine ganz hübsche Metachromasie vorliegen kann. Nach der Farbe der Chromid- cochenillelacke zu urteilen, und da bekanntlich die glatte Muskulatur nicht wenig Chromidhydroxydverbindungen zu binden vermag (so sieht sie an den in Chromalaun gebeizten Stücken ganz graugrün aus), ver- mute ich daher, daß diese „Metachromasie" auf die durch die lange Stückfärbedauer bewirkte Bildung von Chromidcochenillelack statt der Tonerdecochenillelack beruht. ^) Hat natürlich nur experimentelle Bedeutung. XXII, 1. Hansen: Über Hämateinlösnngen und Coclienillefarblösungen. 89 Literaturverzeichnis. (Die allgemeine chemische Literatur ist nicht angeführt.) I. F achchemische Literatur. 1) Erdmann, 0. L. , Über das Hämatoxylin (Journ. f. prakt. Chemie Bd. XXVI, 1842, p. 193-216 [Grundlegendes Werk]). 2) Ref. desselben in: Annalen der Chemie und Pharmacie, herausg. von WÜHLER u. Liebig. Bd. XLIV, 1842, p. 292—296. 3) Handwörterbuch der reinen und angewandten Chemie von Liebig, PoGGENDORFF u. WÜHLER. Bd. III, 1848, Artikel: Hämatein und Häma- toxylin, p. 757—762. 4) Erdmann, 0. L., Vermischte Mitteilungen. 7. Über das H.ämatoxylin (Journ. f. prakt. Chemie Bd. LXXV, 1858, p. 218—224). 5) Hesse , 0. , Über das Hämatoxjdin (Ann. d. Chemie u. Pharmacie Bd. CIX— CX, 1859, p. 332—341). 6) Beim, F., Über das Hämatoxylin (Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 1871, p. 329—334). 7) Hummel, J. J., u. Perkin, A. G. , Über einige neue Verbindungen des Hämateins und Brasileins (Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 1882, p. 2337 — 2347 [u. a. eine einfache Darstellungsmethode des Hämateins]). 8) Erdmann, E., u. Schultz, G., Über das Hämatoxylin und Hämatein (Ann. d. Chemie u. Pharmacie Bd. CCXVI, 1883, p. 232—240). 9) NiETZKi, R. , Chemie der organischen Farbstofie. 2. Aufl. Berlin 1894. 3. Aufl. 1897. 4. Aufl. 1901. 10) RuPE, H., Chemie der natürlichen Farbstoffe. Braunschweig 1900. ' 11) HuJLMEL, J. J., u. Knecht, E. , Die Färberei und Bleicherei der Gespinstfasern. 2. Aufl. Berlin 1891. 12) Kostanecki , St. v. , Lampe , V. , Studien über das Brasilin (Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 1902, Bd. 11, p. 1667—1674). 13) BoLLiNA, E, , Kostanecki, St. v. , Tambor, J. , Studien über das Brasilin (Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 1902, Bd. II, p. 1675—1679). 14) Kostanecki, St. v. , Rost, A. , Naphthalin aus Umwandlungspro- dukten des Hämatoxylins (Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 1903, Bd. II, p. 2202 — 2206; vgl. auch ein paar andere Artikel daselbst von v. Kostanecki). 15) Perkin, W. H. jun., Über den Abbau des Brasilins (Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 1902, Bd. III, p. 2946—2947). 16) Herzig, J., u. Pollak, J., Über Brasilin und Hämatoxylin (Ber. d. deutsch, ehem. Ges. 1903, Bd. I, p. 398—400). 17) Herzig, J. , u. Pollak, J. , Brasilin und Hämatoxylin (ibid. 1903, Bd. II, p. 2319-2320). 18) Herzig, J., u. Pollak, J. , Über Brasilin und Hämatoxjiin (ibid. 1903, Bd. IV, p. 3713—3715). II. Mikro technische Literatur (nur eine Auswahl). 1) Benda, C, Über eine neue Färbemethode des Zentralnervensystems und Theoretisches über Häraatoxylinfärbungen [Eisenhämatoxylin] (Arch. f. Anat. u. Physiol., Physiol. Abt., 1886, p. 562—564). 90 Hansen: Über Hämateinlösungen und Cochenillefarblösungen. XXIl, 1. 2) Mayer, P., Über das Farben mit Hämatoxylin (Mitteil. d. zool. Stat. Neapel Bd. X, 1891, p. 170 — 18G [macht auf das Hämatein auf- merksam]). 3) Heidenhain, M. , Neue Untersuchungen über Zentralkörper (Arch. f. mikrosk. Anat. Bd. XLIII, 1894 [s. p. 431—432, Eisenhämatoxylin]). 4) Benda, C, Zellstrukturen und Zellteilungen des Salamanderhodens (Verb. d. anat. Ges., VH. Vers. Göttingen 1893, p. 1(51— 165 [Eisenhäma- toxybnj). 5) Hansen, Fr. C. C. , Eine schnelle Methode zur Herstellung des Böhmer sehen Hämatoxylins (Zool. Anz. No. 473, 1895, Febr. [Das quan- titative Verfahren bei der Oxydation des Hämatoxylins in Hämatein]). G) Mayer, P., Über Hämatoxylin, Karmin und verwandte Materien (Zeitschr. f. wiss. Mikroskopie Bd. XVI, 1899, p. 196-220). 7) Janssens et Leblanc, Recher dies cytologiques sur la cellule de la levure (La Cellule t. XIV, 1898); Ref. in Zeitschr. f. wiss. Mikrosk. Bd. XV, p. 264 (hematoxyline noire). 8) Mayer, P., Beruht die Färbung der Zellkerne auf einem chemischen Vorgang oder nicht? (Anat. Anz. Bd. XIII, 1899, p. 313—322). 9) Lee U.Mayer, Grundzüge der mikroskopischen Technik. 2. Aufl. 1901. 10) Lee et Henneguy, Traite des methodes techniques de l'anatomie microscopique. Paris 1896. 11) Enzyklopädie der mikroskopischen Technik Bd. I — II. Berlin 1903. (Verschiedene Artikel.) 12) Weigert, K., Eine kleine Verbesserung der Hämatoxylin- van Gieson- Methode (Zeitschr. f. wiss. Mikrosk. Bd. XXI, 1904, p. 1—5). 13) ScHULTZE, 0., Über Stückfärbung mit Chromhämatoxylin (Zeitschr. f. wiss. Mikrosk. Bd. XXI, 1904, p. 5—9). 14) Peter, K., Eine neue Dotterfärbung (Zeitschr. f. wiss. Mikrosk. Bd. XXI, 1904, p. 314—320). Kopenhagen, 9. März 1905. [Eingegangen am 30. März 1905.] XXII, 1. Rüzicka: Zur Theorie der vitalen Färbung. 91 [Aus dem k. k. hygienischen Institut des Prof. Dr. Gust. Kabrhel in Prag.] Zur Theorie der vitalen Färbung. Von Dr. Tlaflislav Rüzicka, Institut sassistent . Durch eine ausgedehnte Versuchsreilie ist es mir gelungen , in dem tinktoriellen Verhalten des lebenden und toten Protoplasmas eine Differenz nach der Richtung hin zu eruieren , daß sich das lebende rot, das tote aber blau färbt, wenn man ihm ein äquimole- kulares Gemisch von Neutrah-ot und Methylenblau vorsetzt. Die Methode gestaltet sich folgendermaßen : Man mischt 0'05prozentige Lösungen von Neutralrot und Methylen- blau medic. Höchst in destilliertem Wasser zu gleichen Teilen. Von dem Gemisch tropft man auf gut gereinigte Objektträger und läßt die Tropfen bei 35^ C. im Trockenschrank verdampfen. Auf die angetrocknete Farbschicht bringt man sodann das Objekt in dem für dasselbe isotonischen Medium, das hiermit zugleich als Lösungs- mittel des Färbegemisehes dient. Die verwendeten Farbstoffe sind beide basischen Charakters, ihre Konstitution ist, wie aus den nachstehenden, Pappenhedis Farb- chemie (St. 381 lind 376) entnommenen, Formeln zu ersehen ist, sehr analog. CeH3N(CH3).3 N(^ ^N Mol. Gewicht 252-53 Neutralrot. C^H,— NH., \ GH, C«.H,N(CH3), CeH3 = N(CH3)., Nl^ ;S Mol. Gewicht 284-36 Methylenblau. 92 Ruzicka: Zur Theorie der vitalen Färbung. XXII, 1. Infolge dieses ümstandes erscheint das elektive Verhalten der beiden Farbstoife sehr interessant, und zwar um so mehr, als keine zwingenden Gründe vorhanden sind, um bei denselben ein verschie- denes Molekularvolumen anzunehmen. Es ist im Interesse der Theorie der Färbung sicherlich wichtig, ein klares Bild Aon den Vorgängen, welche bei Anwendung meiner Methode die Färbung ermöglichen, zu erhalten. Dies werde ich nun hier zu entwerfen trachten. Wie die Er- kenntnis dieser Vorgänge das tiefere Eindringen in die Struktur- unterschiede zwischen dem lebenden und toten Protoplasma zu fördern vermag, habe ich an einer anderen Stelle dargelegt.^ Um eine leichtere Analyse dieser Vorgänge zu ermöglichen, suchte ich den Färbungsakt in seinen Hauptkomponenten: 1) Dem Eindringen des FarbstotFes in die Zelle und 2) der (sei es physikalischen oder chemischen) Bindung des Farbstoftes in der Zelle näher zu erfassen. Hierbei ging ich von der Voraussetzung aus , daß sich die lebende Substanz in mehr oder minder flüssigem Zustande befindet und aus zwei Schichten von verschiedener Dichte , einer äußeren dichteren imd einer inneren flüssigeren, besteht. Denkt man sich eine derartig zusammengesetzte Zelle von einer Flüssigkeit umgeben, so wird sich ihre Außenschicht den von derselben getrennten Flüssig- keiten (d. h. dem Medium und der Innenschicht) gegenüber wie eine Membran verhalten. Die physikalischen Eigenschaften dieser Membran werden für den Austausch der durch dieselbe getrennten Flüssig- keiten entscheidend sein. Da es sich in meinem Falle darum handelt, nur das Verhalten von basischen Farbstoffen zu prüfen, so kann der Umstand, daß die vorliegende Membran nicht für alle Stoffe permeabel ist (da mit Ausnahme von Methylorange und der Tropäoline 00 und 000 keine saueren Farbstoffe dieselbe zu durchdringen vermögen) , vernach- lässigt werden. Somit nehmen wir die Membran als unveränderlich und für wässerige Lösungen basischer Anilinfarbstoffe durchgängig an , wo- durch der vorliegende Fall auf seine einfachsten Bedingungen zu- rückgeführt erscheint. 1) Siehe meine Arbeit „Über tinktorielle Diff'erenzen zwischen leben- dem und abgestorbenem Protoplasma" (Pflügers Arch. 1905). XXII, 1. Ruzicka: Zur Theorie der vitalen Färbung. 93 Dies alles angenommen , haben wir einen Fall vor uns , in welchem die Färbung nach den Gesetzen der einfachen Ditfusion vor sich gehen sollte. Daß die Diffusion gelöster Stolfe in Colloiden mit derselben Geschwindigkeit vor sich geht wie in wässerigen Lö- sungen, hat bereits Graham (1862) bewiesen. Diesen Gesetzen gemäß werden Farbstofflösungen mit einer Schnelligkeit aufgenommen, welche der Konzentration der Lösungen proportional und von der Reibung der Farbstoffmoleküle abhängig ist. Die Diffusion dauert solange , bis die Konzentrationen der zu beiden Seiten der Membran befindlfchen Flüssigkeiten ausgeglichen sind. Bei einem elektrolytisch vollkommen dissoziierten Färbegemische, wie es in unserem Falle vorliegt, müßte schließlich die Lösung zu beiden Seiten der Membran gleich, d. h. im Mischtone, also violett, gefärbt erscheinen. 3Iit Hinblick darauf ist es klar, daß die Ergebnisse meiner Versuche die angedeutete einfache physikalische Deutung nicht zu- lassen; denn das Gemisch müßte mit derselben Geschwindigkeit diffundieren, wie die dasselbe zusammensetzenden Einzellösungeu. Dies tritt jedoch nicht zutage, denn die lebenden Zellen entnehmen dem Gemische nur die rote, die toten nur die blaue Farbe. Diese mit aller Sicherheit^ konstatierte Tatsache gestattet eine zweifache Deutung : 1) Beide Farbstoffe dringen in die Zelle ein, docli unterliegt der eine, je nach Leben oder Tod der Zelle, chemischen Umwand- lungen, so daß stets nur der zweite zum Ausdruck gelangt. 2) Das Methylenblau kann in die lebende Zelle nicht eindringen, weil sich dem Durchtritte seines Moleküls durch die Zeilaußenschicht ein für seinen Partiärdruck unüberwindlicher Widerstand ent- gegenstellt. Der zweiten Deutung gemäß müßte man dafürhalten, daß die Außenschicht der lebenden Zelle nur dem Neutralrotmolekül form- adäquate Poren besitze , und daß dieselben erst durch den Tod der Zelle eine auch für das Methylenblaumolekül formadäquate Gestaltung erfahren. Es leuchtet jedoch ein , daß — wenn diese Deutung richtig wäre — die definitive Färbung der (toten) Zelle wiederum violett sein müßte. Sie ist jedoch rein blau. Nur Bakterien und Hypho- myceten lassen sowohl während des Lebens , als auch nach dem ^) Siehe diesbezüglich meine oben citierte Arbeit. 94 Rüzicka: Zur Theorie der vitalen Färbung. XXII, 1. Tode eine violette Färbung erkennen. Doch tritt auch bei ihnen der Unterschied zutage , daß intra vitani die rote , post mortem die blaue Farbe entschieden überwiegt, so daß man — wollte man diese Tatsache durch einfache Diffusion erklären — zu mindestens suppo- uiereu müßte , daß der Durchtritt des Methylenblaus durch die Bakterien- und Hyphomyceteumembrau intra vitam erschwert er- scheint. Diese Erschwerung der Diifusion würde aber einer physi- kalischen Erklärung große Schwierigkeiten bereiten. Es ist außerdem hinlänglich bekannt, daß das Methylenblau auch bei der gewöhnlichen Verwendungsweise lebende Zellen sehr gut färbt, so daß jede Annahme eines Widerstandes, den ihre Außen- schicht dem Methylenblaumolekül entgegensetzen sollte, hinfällig wird. Dasselbe gilt auch von den Bakterien. Milzbrandbazillen, die ich in einem Bouillontropfen auf eine trockene Methylenblauschicht brachte und auf diese Weise gefärbt habe, übertrug ich aus dem Präparate nach einer halben Stunde auf frischen schrägen Agar, und konnte sie so weiterzüchten. Der Annahme chemischer Vorgänge bei meiner vital-letalen Fär- bung steht der Umstand entgegen , daß es möglich ist , sowohl eine lebende, wie eine tote Zelle singulär ebeiiso mit dem Neutralrot, als mit dem Methylenblau zu färben. Wie könnte man da annehmen, daß die differentielle Tinktion : Rotfärbung der lebenden und Blau- färbung der toten Zelle aus dem Gemische der beiden Farbstott'e, auf einer chemischen Grundlage zustande kommt? Freilich wird die Färbung im Tone einer konzentriertereu Lö- sung vollendet , als die färbende Flotte war , und dieser Umstand wurde von manchen als ein Zeichen chemischer Bindung des Farb- stoffes angesehen. Daß dies nicht immer der Fall ist, beweisen die Versuche von Spiro. ^ Doch haben seine Schlüsse nur für tote Gegenstände Geltung. Immerhin könnte man noch einen Deutungsversuch im Sinne der physikalischen Färbungstheorie unternehmen, indem man, Over- TONS Beispiel foFgend, van t'Hoffs Theorie der festen Lösungen und das sogenannte Teilungsprinzip Giorgieviczs zu Rate ziehen würde. OvERTON- hat die Behauptung aufgestellt, daß die Zellaußen- schicht nur dann für einen Stoff permeabel sei, wenn er in einem ^) Über physikalische und physiologische Selektion. Ötraßburg 1897. -) Viertelj. d. naturf. Vers, in Zürich. XLIV. 1899. XXII, 1. Rüzicka: Zur Theorie der vitalen Färbung. 95 Gemisch von Cholesterin , Lecithin nnd Protagon löslich ist. Die genannten Stoffe sollen in der Außenschicht der Zelle stets enthalten sein und haben die Eigenschaft, sehr große Quantitäten von AVasser aufnehmen zu können. Dieser Umstand erklärt die Durchlässigkeit der Zellaußenschicht für das Wasser. Applizieren wir nunmehr das eben Angeführte auf den Färbungs- akt , so haben Avir erstens zu erwälnien , daß sämtliche basische Farbstoffe in Cliolesterin, Lecithin etc. löslich sind. Des weiteren habe ich anzuführen , daß Overton ursprünglich der Ansicht war , daß die Farbsalze beim Eindringen in die Zellen durch Hydrolyse, infolge der Einwirkung der schwachen Gewebs- säuren, dissoziiert werden und als Basen mit den Säuren der Zellen zu Farbsalzen zusammentreten. Diese chemische Ansicht vom Färbe- akte hat OvERTOx nachher ^ geändert und nimmt nunmehr an , daß in vielen Fällen — zu welchen auch die Färbungen mit Neutralrot und Methylenblau gehören — die Farbstoffe als solche in die Zelle aufgenommen werden. Ich glaube diese Behauptung bestätigen zu können. Die Farbstoffe gelangen also durch Diffusion in die Zelle. p]s fragt sich nun, auf welche Weise sie die Färbung im Tone einer kouzentrierteren Lösung vollbringen. Nach Overton wird dies durch mechanische Verteilung des Farbstoffes auf die Farbflotte und auf das zu färbende Objekt be- werkstelligt. Der Konzentrationsunterschied des Farbstoffes stammt dalier, daß die Substanz der gefärbten Teile für den Farbstoff ein größeres Lösungsvermögen zutage gelegt hat , als das Wasser der Farbflotte. Wie lichou erwähnt, schreibt Overton dieses größere Lösungsvermögen der Gegenwart von Cholesterin, Lecithin, Protagon, Cerebrin zu. Zugunsten dieser Ansicht führt er an, daß diese Stoffe, wenn sie in sehr verdünnten Lösungen von basischen Farbstoffen suspendiert werden, die Farbstoffe an sich ziehen. Dies ist jedenfalls ein bemerkenswertes Resultat. Docli gibt Overton selbst an , daß er nicht zu erklären weiß , wie es kommt, daß sich in Nervenfäden zwar die Achsenzylinder, nicht aber das Mark, welches doch soviel Protagon enthält, mit Methylenblau färben. Auch dafür bleibt die Erklärung aus, wieso das Methylenblau, welches doch in lebende Zellen leicht eindringt, daselbst keine kräftige Färbung entfaltet. Dem habe ich noch hinzuzufügen , daß auch die intravitalen 1) Jahrb. f. wiss. Botanik. XXXIV. 1900. 96 Rüzicka: Zur Theorie der vitalen Färbung. XXII, 1. Kernfärbungeu auf Grund der Annahme Overtons nicht erklärt werden können 5 einmal treten sie ein, das andere Mal nicht , auch kann die einmal erzielte Kernfärbung wieder zurückgehen, um ent- weder nie mehr oder später wieder von neuem aufzutreten. Kann da auch ein Cholesterin etc. - Gehalt zur Erklärung herangezogen werden und selbst wenn man einen Wechsel desselben annimmt? Es scheint also, daß die Erklärung Overtons auf allgemeine Gültigkeit keinen Anspruch erheben kann. Damit will ich jedoch keineswegs bestreiten, daß die Proto- plasmasubstanzen den Farbstotfen gegenüber ein großes Lösungs- vermögen zutage legen können. Es geht dies ja aus meinen eigenen Versuchen, bei welchen Neutralrotfärbungen lebender Zellen fast momentan vollendet wurden, klar hervor. Wollte man jedoch das Resultat meiner vital-letalen Färbung nach dem Muster von Overton bloß auf das Teilungspriuzip zurück- führen, so würde man auf unüberwindliche Schwierigkeiten stoßen. Man könnte durch dasselbe wohl vielleicht die singulären Fär- bungen erklären. Wollte man aber das Ergebnis der Färbung mit meinem Gemische durch das Teilungsprinzip erklären, so müßte man vorerst eine Deutung für die Tatsache finden^ daß durch Anwendung meines Gemisches die lebende Zelle nur rot, die tote nur blau ge- färbt wird, wobei im letzteren Falle die ganze Farblösung abgefärbt erscheint. Ist es etAva zulässig, die Annahme aufzustellen, daß die lebende Substanz nur für das Neutralrot, die tote nur für das Me- thylenblau Lösungsvermögen aufweist ? Selbst wenn wir keinen andern naheliegenden Einwurf berücksichtigen würden, so wäre zu bedenken, daß bei dieser Annahme der SchlußefFekt der Färbung sich in vio- letter Mischtinktion kundgeben müßte, was jedoch nicht der Fall ist. Ich möchte an dieser Stelle auch eines schönen Versuches Er- wähnung tun, der auf Hamburgers^ Veranlassung von Versteeg und DE Vries ausgeführt worden ist. Durch Vergleichung der Ge- frierpunkterniedriguugen einer Farbstotf- und einer Eiweißlösung mit derjenigen eines Gemisches der beiden konnte eruiert werden, daß das Neutralrot mit dem toten Eiweiß keine chemische Verbindung eingeht, während das Methylenblau eine solche bildet. 1) Osmotischer Druck etc. Bd. III (St. 423, Anmerkung). Dieser Ver- such war mir, wie ich ausdrücklich konstatiere, zurzeit der Ausarbeitung meiner eigenen Versuche noch nicht bekannt und bringe ich ihn erst hier mit den letzteren in Beziehung. XXII, 1. Riizicka: Zur Theorie der vitalen Färbung. 97 Dieses Ergebnis kann mit meinen Versuchsresultaten in guten Einklang gebracht werden. Ich habe durch Versuche, in welchen ich ganz geringe Quanti- täten Farbstoff mit lebenden Zellen in Berührung brachte , zeigen können, daß Zellen, welche das Neutralrot intra vitam aufgenommen Laben, postmortal diese Färbung abgaben, während Zellen, welche intra vitam das Methylenblau nicht aufgenommen haben, sich post mortem mit demselben färbten. Dieses Resultat wäre im Hinblick auf den obigen Versuch Hamburgers dahinaufzufassen, daß in der letzteren postmortalen Methy len blaufärb ung eine chemische Färbung vor- liegt. Durch diese Annahme erklärt sich, warum in den Färbe- versuchen mit meinem Geraische nie eine postmortale Neutralrotfärbung zustande kam , obwohl das Gemisch äquimolekular war. Die intra- vitale Abfärbung des Methylenblaus ist ja auch nicht anders auf- zufassen, als ein chemischer Vorgang. Es handelt sich nunmehr noch darum, den Charakter der vitalen Neutralrotfärbung zu beleuchten. Aus Hamburgers Versuche geht hervor , daß bei der Neutralrotfärbung des toten Eiweißes keine chemische Verbindung zustande kommt. Die Färbung muß also durch physikalische Vorgänge von statten gegangen sein. Dies lassen meine Versuche sehr scharf sehen. Eine während des Lebens durch Neutral- rot gefärbte Zelle entfärbt sich, während sie abstirbt. Doch tritt diese Entfärbung, meinen Versuchen gemäß, nur dann ein, wenn man nicht eine relativ zu gr oß e F ar b s 1 ff menge verwendet h a t. Färbt man jn einem relativen Überschusse des Farbstoffes, so tritt bei singulärer Färbung auch eine Neutralrottinktion der toten Zellen ein. Die Abfärbung tritt dann selbst vorübergehend nicht in Sicht. Färbt man lebende Zellen in einem relativen Überschusse von Methylenblau, so erzwingt man in analoger Weise eine Färbung, doch ist diese Färbung in ihrem Wesen eine physikalische ; denn benützt man relativ wenig Farbstoff, so kommt es zu einer Methylen- blaufärbung erst nach dem Absterben der Zelle. Es ist also klar, daß bei der P^ärbung mit meinem Gemische das elektive Resultat nur auf chemischen Vorgängen beruhen kann. Beide Farbstoffe sind in meinem Gemische in relativem Überschusse vorhanden. Während bei singu- lärer Färbung unter solchen Umständen eine physikalische Tinktion eintritt, führt die simultane Doppelfärbung mit dem äquimolekularea Gemische zum Ausdrucke der chemischen Vorgänge, Zeitschr. f. wiss. Mikroskopie. XXII, 1. 7 " 98 Ruzicka: Zur Theorie der vitalen Färbung. XXII, 1. Dies wird durcli Aveitere von mir ausgeführte Versuche und Beobachtungen bekräftigt, welche den Beweis liefern, daß die beiden Farbstoffe in der Zelle gleichzeitig vorhanden sind. Darauf weisen die nachfolgenden Beobachtungen hin. Der mittel- ständige Kern ist oft das erste , was sich in einer sonst nur von dem roten Farbstoff gefärbten Zelle blau tingiert ; die in den Nahrungs- vakuolen sonst gänzlich rot gefärbter Amöben enthaltenen Bakterien sind blau ; ein rot gefärbtes Infusorium zeigte , von einem andern gleichfalls rot gefärbten verschlungen, augenblicklichen Wechsel der Färbung ins Blaue ; inmitten rot gefärbter Granula erscheinen blau tingierte. Die Farblösung entfärbt sich, so daß bei Schluß des Ver- suches (d. h. nachdem die Zellen abgestorben sind) sich soAvohl der rote , als auch der blaue Farbstoff in den gefärbten Objekten be- finden muß. Bewiesen wird die gleichzeitige Gegenwart beider Farbstoffe in der Zelle durch Zusatz von Wasserstoffsuperoxyd. Durch Oxyda- tion des zweiten, in der Zelle enthaltenen, jedoch nicht sichtbaren Farbstoffes — der mit dem sichtbaren komplementär ist — tritt sodann in den Zellen violette Mischfärbung auf. Somit kann als bewiesen gelten, daß bei Anwen- dung meines Geraisches in der lebenden Zelle das Methylenblau, in der toten das N e u t r a 1 r o t zwar ent- halten, jedoch durch die chemischen Einflüsse des Protoplasmas unsichtbar gemacht worden sind. Wie aus meinen Versuchen hervorgeht , beruht diese Einwirkung des Protoplasmas auf seinen reduzierenden Eigenschaften. Bezüglich meiner weiteren biologischen Ausführungen muß ich auf meine eingangs zitierte Arbeit hinweisen. An diesem Orte wollte ich nur jene Resultate hervorheben, welche sich auf die Theorie der vitalen histologischen Färbung beziehen und zum ersten Male zeigen, daß die Neutralrotfärbung der lebenden Zelle ein chemischer Vorgang ist, a\- ä h r e n d die Methylenblau- f ä r b u n g der lebenden Zelle zwar ein vitales Phäno- men ist, aber auf physikalischer Grundlage beruht. [Eingegangen am 28. Februar 1905.] XXII, 1. Cristina: Nouvo metodo per attaccare i tagli fatti da pezzi, 99 Nuovo metodo j^er attaccare i tagli fatti da pezzi inclusi in celloidina. Per il Dr. Di Cristina. Dato clie con le nuove manipolazioni proposte da Apathy, si possono ottenere sezioni sottillissime a cominciare da tre /*, si preseiita di nuovo la questione deirappicicatura dei tagli. Due gravi incove- nienti presenta adesso l'inclusione in celloidina : 1^ Che alcuni organi come intestiuo , stomaco in sezioni sottili non resistono alle mani- polazioni di colorazione , disidratazione guastandosi. 2^ Le sezioni in celloidina non attaccate al portaoggetti , non possono essere disi- dratate convenieutemente , perclie la celloidina negli alcool forti si discioglie, rovinando cosi' le sezioni, — Ho cercato di ovviare a questo inconveniente servendomi di un metodo semplicissimo di appicciatiira dei tagli sul vetrino portaoggetti. Questo metodo permette ancbe la preparazione dei tagli in Serie in modo semplicissimo. II procedimento e il segueute : Le sezioni fatte se sono giä colorate in massa vengono trasportate in acool a 94*^ perö devono qui soggiornare il meno possibile, se non sono colorate possono essere colorate prima di attaccarle, e come ultimo vanno trasportate in alcool a 94°, qui semplicemente devono restare un tempo brevissimo. Si preparano prima dei vetrini portaoggetti, su cui si spalma uno Strato di alburaina glicerinata cosi composta: Albumina d'uovo parti 5, Glicerina neutra parti la. Con una striscia di carta bibula introdotta nella vascbetta con- tenente le sezioni, si cerca di prendere le sezioni in modo perö che esse vengono distese sulla carta senza far pieghe. Quindi si tira la carta per un estremo facendo in modo che le sezioni vi rimangano attaccate. Questa striscia di carta si adaggia dal lato ove stanno distese le sezioni, sul vetrino portaoggetti gia spalmato di albumina, sü di essa si adaggiano altre striscie asciutte e si preme un pö col palmo delle dita fiuche i tagli restano distesi. — Per l'azione coagu- 100 Fischer: Sperrvorrichtung für mikroskup. Demonstrationen. XXII, 1, lante dell'alcool suiralbumiua i tagli restano appicciiiati solidameute. — I tagli cosi trattati possono essere sottoposti a tutte le mani- polazioni, ed infine se ne piio alloutauare la celloidiua coiralcool assoluto senza che 11 preparato sublsca delle alterazlonl. — Le sezioni attaccate vanuo trasportate subito in alcool assoluto. 81 deve perö badare che l'albumlna glicerinata conteuga molta albumina, polche se pre- domina nella soluzlone in suo luogo la gllcerina, 11 metodo nun rlesce. Berlin, 26. März 1905. [Eingegangen am 29. März 1905.] Eine Sperrvorrichtung für mikroskopische Dem onstrationen. Von Alfred Fischer in Basel. Hierzu zwei Holzschnitte. Jeder, der mikroskopische Präparate zu demonstrieren hat, kennt den Übelstaud, daß Unerfahrene die Mikrometerschraube nicht sachgemäß benutzen und auch gelegentlich den groben Trieb miß- brauchen. Die Einstellung wird gestört, die Präparate werden zerquetscht. Auf der Städteausstellung 1903 in Dresden war eine große Zahl Mikroskope aufgestellt, mit denen jedermann Bakterienpräpa- rate , die durch besondere Vorkehrungen an den Mikroskopen völlig geschützt waren, betrachten konnte. Jeder neu Hinzutretende konnte sich mit der partiell gesperrten Mikrometerschraube das Bild selbst wieder einstellen. Die dort verwendeten Einrichtungen, die für wissenschaftliche Demonstrationen zu kostspielig und zum Teil über- flüssig sein würden , erweckten in mir den Wunsch , auf einfachere Weise dem allbekannten Übelstande abzuhelfen. Mit Avesentlicher Unterstützung des Herrn Mechaniker Dijrrenberger in Basel habe XXII, 1. Fischer: Sperrvorrichtung für mikroskop. Demonstrationen. lOl ich eine solche Einrichtung für ein größeres Stativ, etwa Zeiss No. Ja, zusammengestellt. Auf wohlfeile Art kann man die grobe Einstellung durch Kapseln aus steifem Karton verdecken. Figur 1 zeigt eine elegantere Ein- richtung, die eine Verkoppelung und Vereinfachung der von Zeiss gelieferten Schutzhülsen für die grobe Schraube ist. Diese Zeiss sehen Hülsen müssen in zweimal 2 besondern Handgriffen über die beiden Schraubenknöpfe geschoben werden. Jede dieser Hülsen besteht aus zwei ineinander passenden Ringen: man muß erst den einen 1. 2. In einer Photographie des montierten Mikroskopes sind die beiden Teile der Schutzeinrichtung nachträglich schärfer hervorgehoben. Der herunter- geklappte Sperrzeiger liegt zwischen dem rechts sichtbaren und dem vom Schraubenkopf verdeckten dritten Stift. Figur 2 ist das einfachere Modell des Sperrzeigers, rechts und links sieht man die Federn. (Photographiert und gezeichnet von Herrn Dr. Th. Frank.) Ring über den Knopf schieben und dann den zweiten Ring aufsetzen. Da die beiden Ringe fest aufeinanderpassen müssen, damit die Hülse gut zusammenhält, so geht dieses Aufsetzen der Hülsen keineswegs schnell und auch nicht ohne Verschiebung der Einstellung vor sich. Die gekoppelten Hülsen, die ich hier vorschlage, werden mit einem 102 Fischer: Sperrvorrichtung für mikroskop. Demonstrationen. XXII, 1. einzigen Griff aufgesetzt und verdecken die Schraubenknöpfe so vollständig (Fig. 1), daß nicht mehr daran gedreht Averden kann. Je nach der Form des Statives, der Ansatzhöhe des Triebes und anderem wird die Verkoppelung der Hülsen verschieden vor- zunehmen sein. Die Figur zeigt das Modell für ein ZEisssches Stativ. An dem Schraubenknopf rechts hebt sich schwarz ein Metall- ring von 4'4 cm Gresamtdurchmesser, ca. 3 cm im Lichten ab. Der aus geschwärztem Messingblech hergestellte Ring ist etwa 7 mm breit und trägt einen nicht den ganzen Umfjing einnehmenden 8 mm hohen Aufsatz , der so angebracht ist , daß er etwa ^/., des Schrauben- knopfes von oben verdeckt (Fig. 1 links und rechts). Diese beiden Ringe sind durch einen Metallsteg , dessen Länge aus der Distanz der Schraubenknöpfe sich ergibt, verkoppelt. Die Koppelung trägt an der Tubusseite eine Rinne, deren Form genau dem Querschnitte der Führungsleiste für die Triebstange entspricht und so weit ist, daß bequem übergeschoben werden kann. Außerdem ist die Koppe- lung in der Mitte , wo die Rinne eingeschnitten ist , nach abwärts eingeknickt , damit sie auf dem kleinen Vorsprung des Statives (Fig. 1) aufliegt. Für die Sperrung der Mikrometerschraube empfiehlt sich folgende Einrichtung. Auf den Schraubenknopf (Fig. l) werden in gleichen Abständen eine Anzahl, etwa 4 mm hoher Metallstifte, deren Distanz durch die Feinheit der Schraube bedingt ist, eingesetzt. Wenn diese bei einer Umdrehung ■'/^ mm leistet , so genügen 2 oder 3 solcher Stifte, bei älteren Stativen mit gröberer Schraube 4 oder 5, je nach Belieben. An jener Stelle des Statives, die den Zeiger für die Ablesung der Schraube trägt, wird ein zurückklappbarer Zeiger eingesetzt, der auf den Schraubenknopf heruntergeklappt zwischen den Stiften liegt und die Drehung der Schraube nur so weit gestattet, bis er an einen der Stifte anschlägt. Der Zeiger muß zwar etwas kräftiger sein als der Ablesezeiger, kann aber doch noch so dünn bleiben, daß er auch für nicht allzu feine Ablesungen verwendet werden kann. Für diesen Sperrzeiger sind zwei Modelle abgebildet. In Figur 1 wird der Zeiger mit dem Schräubchen rechts umgeklappt, mit dem links festgestellt. Diese Einrichtung ist sehr zuverlässig und ge- stattet dem Beobachter nicht, die Sicherung abzustellen. Das andere Modell (Fig. 2) ist einfacher und genügt im allgemeinen. Der Zeiger wird mit dem Schräubchen rechts herausgeklappt und durch zwei Federn in dieser Stellung gehalten. Verwendet man diese einfachere 1 I XXII, 1. Fischer: Sperrvorrichtung für lulkroskop. Demonstrationen. 103 Siclierimg, so muß man allerdings die Hörer darum bitten, diesen Zeiger nicht heraufzuklappen, sondern nur an der Mikrometerschraube zu drehen, bis sie anstößt. Das Präparat wird wie üblich eingestellt, der Sperrzeiger herunter- geklappt und die Sicherung für den groben Trieb aufgesetzt. Eine kleine Aufmerksamkeit ist vorher notwendig. Sollte der Sperrzeiger zu nahe an einen der Stifte herangekommen sein bei der Einstellung mit normalsichtigem Auge, so würde für die beiden Extreme der fehlerhaften Augen der Spielraum zu ungleich sein. Man achte darauf, daß bei normaler Einstellung der Zeiger etwa in der Mitte zwischen zwei Stiften steht. Ist dies nicht sogleich zufällig erreicht, so klappt man den Zeiger wieder herauf, hebt mit der groben J^instellung den Tubus eine Spur, stellt mit der Mikrometerschraube wieder genau ein und klappt den Sperrzeiger wieder herunter. Vielleicht wird noch einmal diese Nachhilfe zu wiederholen sein, bis der Zeiger die gewünschte Stellung hat. Wer diese kleine Nachhilfe möglichst vermeiden will, der lasse in den Knopf der feinen Mikrometerschraube mit ^/^ mm Umgang nur zwei Stifte einsetzen. Aber selbst bei drei Stiften (Fig. 1) ist diese kleine Einstellungskorrektur so einfach und für den geübten Mikroskopiker so leicht, daß es kaum der Mühe lohnt, darüber zu reden. Ich brauche seit einem Jahr dreistiftige Sicherungen ohne jede Beschwerde. Sobald die Mikrometerschraube mit guter Mittellage des Sperr- zeigers eingestellt ist, werden die gekoppelten Hülsen über den groben Trieb geschoben und damit ist das Präparat völlig geschützt. Die Mikrometerschraube kann weder zu hoch, noch zu tief, bis zum Zer- quetschen des Präparates, gedreht werden, sondern bei drei Stiften nur um ^^ Umgang, bei 2 um Vi »:ich auf- und abwärts. Jeder neue Beobachter kann und muß innerhalb dieser Grenzen die scharfe Einstellung des Präparates finden. Ich erwähne, daß die feinsten Bakterienpräparate ganz Ungeübten so demonstriert werden können und daß einige Mikroskopiker, die diese Schutzeinrichtung kennen lernten, sofort von deren Brauchbar- keit überzeugt waren. Ich habe diese kleine Konstruktion vor einiger Zeit der Firma Zeiss vorgelegt, die mit größter Bereitwilligkeit mir ihre eigenen entsprechenden I^inrichtungen zur Ansicht schickte. Über die von Zeiss gelieferten Hülsen für die Knöpfe des groben Triebes wurde schon gesprochen, die Sperre für die Mikroraeterschraube muß über 104 Arndt: Technik u. Methodik d. mikroskopischen Doppelsäge. XXII, 1. deren Knopf liinweggeschoben werden und ist nicht so bequem zu handhaben wie die hier vorgeführte Zeigersperrung. Leider lehnte es die Firma Zeiss ab, mein Modell auszuführen. Da ich von der Brauchbarkeit meines Vorschlages nach wie vor überzeugt bin, so gebe ich die Einrichtung hiermit allgemein be- kannt, in der Hoffnung, daß sie vielen Kollegen recht gute Dienste leisten wird. Die Herstellung ist so einfach , daß jeder Feinmecha- niker sie in kurzer Zeit ausführen kann. [Eingegangen am 2.5. Februar 1905.] [Aus dem pathologischen Institut der Universität (Obermedizinalrat Prof. Dr. v. BoUinger) und der Prosektur des Krankenhauses rechts der Isar in München (Prof. Dr. Schmaus).] Beitrüge zur Technik und Methodik der mikro- skopischen Doppelsäge. Von Dr. Georg Arndt Assistenzarzt an der Künigl. chirm-g. Klinik in Erlangen, ehem. Volontärassistent des Instituts. Hierzu 5 Holzschnitte. Nach der vor fast vier Jahren erfolgten Veröffentlichung meiner Doppelsäge ^ ward mir erst spät die Gelegenheit zum weiteren Aus- bau der Methode zu teil. Das möge erklären , weshalb in den folgenden Beiträgen erst ein Teil von dem vorliegt, was als nächster Programmpunkt gelten mußte , der allein der Verbesserung des In- strumentariums und der Methodik gewidmet war. Die in der ersten Arbeit niedergelegten Anweisungen für die Behandlung und den Ge- brauch des inzwischen an zahlreichen Instituten eingeführten Instru- ^) Präzisionssäge zur Herstellung mikroskopischer Präparate harter Substanzen (Diese Zeitschr. Bd. XVIII, 1901, p. 146—159). XXII, 1. Arndt: Technik u. Methodik d. mikroskopischen Doppelsäge. 105 ments haben sieb mir und anderen auch weiterhin, selbst bei der Bearbeitung von anscheinend ungeeigneten Objekten bewährt. Es sei aber betont, daß wie für jede andere mikroskopisch -technische Methode, so auch für die Doppelsäge iintadelhafte Beschaffenheit des Instruments und der Sägeblätter, sowie Vertrautheit mit den genannten Vorschriften die natürliche Voraussetzung für ihre erfolgreiche An- wendung bilden. a. Verlängerung der wirksamen Sägefläche. Für die Bearbeitung breiter und umfangreicher Objekte , be- sonders aber auch für die Sicherheit und Schnelligkeit des Sägens ist die Spannweite der Sägeblätter von erheblicher Bedeutung. Der freie Spannraum der Doppelsäge ist nun mit 6*5 cm für die wich- tigsten Zwecke 'zwar hinreichend weit getroffen , doch können von diesem Maße höchstens 4*5 cm benutzt werden , weil die Vorrich- tungen, welche zum Einstellen des gegenseitigen Abstandes der Säge- blätter herunterklappbar angebracht sind , an jeder Seite fast 1 cm fortnehmen (cf. Fig. 1, Darstellung der Doppelsäge mit der alten Stellvorrichtung) ; auch der verbleibende Raum ist nur mit der Vor- sicht zu benutzen, daß beim Sägen die Stellschrauben A: nicht gegen Objekt oder Schraubstock stoßen dürfen, soll nicht die genaue Ein- stellung der Schnittdicke verloren gehen. Da die Spannweite für unsere Mailänder Metallsägen nur unter der Gefahr vergrößert werden kann, daß ihre straffe Spannung, Ein- stellung und Festigkeit Einbuße leidet, so konnte nur von der Ver- änderung der Stellvorrichtung eine Ausnutzung der verfügbaren Spannweite erhofft werden. Es wurden daher die Stellschrauben /i, die bisher direkt auf die Sägeblätter wirkten, weiter nach oben 106 Arndt: Technik u. Methodik d. mikroskopischen Doppelsäge. XXII, 1. verlegt und durch eine gelenkige Vorrichtung mit den Sägen in Verbindung gesetzt, Figur 4 zeigt diese Vorrichtung in natürlicher Größe von vorn, Figur 2 und 3 die damit ausgerüstete neue Säge von der Seite, und zwar Figur 2 mit gebrauchsfertig heruntergeklappter , Figur 3 mit hochgedrehter Stellvorrichtung, Die Buchstabenbezeichnungen der vier ersten Figuren entsprechen einander. Die Stellschrauben k sind in Muttergewinden der Fortsätze f (s. Fig, 2 u, 4) des Sägenteiles a gelagert — mit a sind die festen, mit b die beweglichen Klemmbacken bezeichnet, welche, durch die Schraube e zusammengepreßt, die Sägen c zwischen sich fassen. — m Durch Ftechtsdrehung der Stellschrauben k werden die bei jj mit- einander gelenkig verbundenen Branchen /^ und /„ einer gut ver- stählten zangenartigen Vorrichtung einander genähert und wirken gleichzeitig distanzevermindernd auf die Sägen r?, c (in Fig. 4 im Querschnitt getroffen), welche, wie beim alten Instrument, durch dünne, innerhalb der Klemmbacken a und b zwischen den Säge- blättern eingepreßte Stahlplatten in einem maximalen gegenseitigen XXII, 1. Arndt: Technik u. Methodik d. mikroskopischen Doppelsiige. io7 Abstand gehalten werden. Um den hierdurch gesetzten Widerstand gegen den Druck der Branchen zu verringern, ist jedes der beiden Stahlplättclien an seinem vorderen Rande , entsprechend der Aus- trittstelle der Sägeblätter, mit einer 2 mm' messenden Auskehlung versehen worden. Da jede der Branchen ^^^ und /., kaum O'l cm dick ist und dem Sägenteil a fest anliegt,^ so gehen von der Spann- weite der Sägen insgesamt nur 0'2 cm verloren , es bleiben also 6*3 cm verfügbar. Als weiterer Vorzug gegenüber der alten Säge kommt in Betracht, daß Stöße gegen die Branchen, wie sie beim schnellen Sägen vorkommen , die Genauigkeit der Einstellung nicht stören. Die neue Stellvorrichtung |, f kann auch an der alten Säge angebracht werden. Der Preis für diese Änderung stellt sich auf 10 Mark. b. Methodik. Die Beantwortung der in der ersten Veröffent- lichung der Doppelsäge gestellten Frage , ob frische, feuchte Objekte bessere Schnitte ergeben als trockene , habe ich, außer an Wirbeltierknochen und -zahnen verschiedener Herkunft und Vorbeliandlung, auch an pflanzlichen Hartgebilden geprüft, möchte aber , bei dem verhältnismäßig geringen Umfang des letztgenannten Materials, das folgende Urteil vorwiegend auf tierische Hartgebilde beziehen. Die damals mitgeteilte vereinzelte Beobachtung, daß Präparate von frischen, spongiösen Knochen weit besser gelangen als solche von gleichartigen macerierten Objekten, ist auch später durch zahlreiche vergleichende Versuche bestätigt worden. Das gleiche gilt für die kompakte Knochensubstanz, während Zement und Dentin keinen Unterschied , ob feucht oder trocken geschnitten , erkennen ließen. Knochen, die in Sublimat, Formalin (10 Prozent) oder Alkohol konserviert waren , boten gegenüber frischen Knochen keinen Unter- schied. Röhrenknochen von Neugeborenen und fötale Knochen eines Falles von sogenannter fötaler Rachitis , die "/^ bis 1 Jahr in For- malin gelegen hatten , schienen mir aber an Konsistenz erheblich ^) In Figur 2 sind die Stellvorrichtungen / nur der größeren Deut- lichkeit halber mit einem gewissen Abstand vom übrigen Sägenkörper ge- zeichnet worden. 108 Arndt: Technik u. Methodik d. mikroskopischen Doppelsäge. XXII. 1. abgenommen zu haben und ließen weniger dünne Schnitte zu als im frischen Zustande. Analog den Erfahrungen, die man an Kaiserling- Präparaten mit dem Verschwinden von harnsauren Niederschlägen in Organen gemacht hat/ dürfte in unserem Falle die aus dem Formalin sich bildende Ameisensäure die Entkalkung und Kon- sistenzverminderung der jungen Knochen bewirkt haben. Da es Westenhoeffer durch Einbringen von Quecksilberoxyd (zwischen Fließpapierscheiben am Boden des Gefäßes und in einem Stoffbeutel) in das Gefäß mit der III. Kaiserling sehen Flüssigkeit gelungen ist, die Bildung der Ameisensäure für lange Zeit unschädlich zu machen, so empfiehlt sich dasselbe Vorgehen auch für die Konservierung von Knochen in allen Fällen , wo die Aufbewahrung in Alkohol nicht bevorzugt wird." Das Vergleichsmerkmal für die Beschaifenheit feucht oder trocken gefertigter Präparate bot nicht die geringste erreich- bare Schnittdicke allein, sondern gleichzeitig die Ausdehnung der Schnitte und der Mangel an Artefakten. Im allgemeinen konnten letztere , d. h. Sägerillen , Risse , Abreißungen feiner Bälkchen und Lamellen, an feucht konservierten oder frischen Schnitten weit seltener als an macerierten, trockenen in störendem Maße beobachtet werden. Querschnitte z.B., die von macerierten langen Röhrenknochen oft dünner als von frischen oder feucht konservierten Stücken zu er- halten sind, stehen doch an Vollkommenheit hinter diesen zurück. Längsschnitte lassen sich aus frischen oder feucht konservierten Röhrenknochen stets mindestens ebenso dünn als von macerierten herstellen. Für die Herstellung lebensfrischer Präparate, für die die Schnelligkeit der Sägemethode besonders ins Gewicht fällt, zeigte es sich zweckmäßig, die Schnittstelle und die Sägen während des Schnei- dens fortwährend von physiologischer Kochsalzlösung berieseln zu lassen, einerseits, um die Austrocknung des dünnen Präparatblättchens zu verhüten, anderseits, um die Sägeblätter, die sich sonst erhitzen würden, ständig kühl und leicht gleitend zu erhalten. Die Temperatur- erhöhung der Sägen • — ■ für die übrigens meines Erachtens neben der äußeren noch die innere, aus den Zug- und Druckbeanspruchungen der Sägeblätter und ihrer Zähne hervorgehende Reibung in Betracht kommt — kann den vitalen Zustand des Gewebes verändern, aber auch durch *) Westenhoeffer, Salkowski- Festschrift, Berlin 1904. -) „Sehr schön werden auch Knochen konserviert, besonders Rachitis und Syphihs." Westenhoeffer, 1. c. XXII, 1. Arndt: Technik u. Methodik d. mikroskopischen Doppelsäge. 109 ererhöhte Quelhing der nächsten Umgebung der Sägen die Arbeit des Sägens selber erschweren. Letzteres habe ich an feucht konser- vierten Knoclien und botanischen Objekten auch dadurcli verhindern können , daß ich während des Sägens Glyzerin mit einem Pinsel nicht zu sparsam auf die Schnittstelle tropfen ließ. Bespülung der Schnittfläche mit reichlich Wasser oder der konservierenden Flüssig- keit scheint dem Schneiden unter Glyzerin gleich zu kommen.-^ Zum Auffangen der Flüssigkeit genügt ein zwischen die Wangen des Schraubstocks gestecktes Tuch , welches gleichzeitig zur Ableitung in ein am Boden stehendes Gefäß dient. Ist das Objekt in der unten beschriebenen Schraubkluppe (Fig. 5) fixiert, so findet die Flüssigkeit in dem Kasten a^^ der nicht, wie auf der Abbildung, von dem Holzblock g völlig ausgefüllt wird , Raum zum Sammeln und fließt durch ein Loch in der Stirnwand des Kastens und den Rohrstutzen A:, der zweckmäßig einen Gummischlauch als Fortsetzung erhält, ab. Da es beim Sägen von Vorteil ist, die Finger der linken Hand gegen das Objekt oder den Schraubstock zu stützen , sei es, um Vibrationen des ersteren zu dämpfen oder die Schnittführung sicherer zu gestalten, so ist für die Berieselung der Schnittstelle ent- weder Assistenz nötig oder eine der einfachen Vorrichtungen, wie sie zur Bespülung des Mikrotommessers beim Schneiden von Celloidin- ^) Daß die Sägeblätter nach jedem Gebrauche gereinigt werden müssen, gilt, des Röstens wegen, besonders für Formalinschnitte: man reinigt die Sägen am besten im gespannten Zustande mit einem Wasser- pinsel und trocknet sie durch Zwischenziehen eines Streifens Fließpapier. 110 Arndt: Technik u. Methodik d. mikroskopischen Doppelsäge. XXII, 1. stücken zahlreich angegeben , entweder kontinuierlich oder durch Druck auf einen Gummiball (vom Fuß) zu betätigen sind. Wer die Doppelsäge oft benutzt, empfindet die Berieselung auch als sicheren Schutz gegen die Einatmung des Sägestaubes wohltätig. Aus diesem Grunde , dann aber auch , um die Brüchigkeit der ent- stehenden Präparatblättchen zu mindern und die Gleitfähigkeit der Sägeblätter zu erhöhen , empfahl es sich , auch trockene und mace- rierte Gewebe , besonders wieder Knochen , mit Glyzerin oder nicht zu dünnem Zedernöl an der Schnittstelle zu tränken. Meistenteils verdiente das Sägen mit „Schmierung" den Vorzug, es ging leichter, ohne Staubentwicklung von statten und behütete zweifellos manches Präparat vor dem vorzeitigen Ablösen. Für die Herauslösung des fertig gesägten Blättchens war in der ersten Veröffentlichung die Wahl gelassen worden , es entweder so abzulösen, „wie man es mit Doppelmesserschnitten zu tun pflegt, indem man das Instrument etwas nach links und rechts herüber biegt, während man einige Sägebewegungen ausführt", oder so, daß man die Säge „vorsichtig heraushebt, mit dem Taschenmesser in eine Schnittfurche eingeht und das Präparat an der Haftstelle ab- knickt". Das erste der beiden Verfahren hat sich für Präparate von zartem Gefüge als unzweckmäßig herausgestellt; nur dicke und wenig umfangreiche Schnitte leiden keine Gefahr dabei. Statt eines Taschenmessers bedient man sich beim zweiten Verfahren, besonders dort , wo es sich um tief gehende Schnittfurcheu handelt , besser eines dünnen, scharfen Skalpells ; ist der Schnitt an seiner Haftstelle sehr dünn , so genügt auch ein dünner , aber kräftiger Metallspatel zum Abknicken. Das Herausheben der Säge aus den Schnittfurchen kann bei breiten , tiefen Schnitten Schwierigkeit macheu und zum Zerreißen des Präparates führen; das läßt sich leicht dadurch verhüten, daß man das ganze Stück samt der festsitzenden Säge aus dem Schraubstock nimmt, und dann erst mit größerer Freiheit, die Säge heraus hebelt. Zum Einschluß des D au e r pr äp ar a t e s dient mir Canada- balsam (sc. harter) nur für Präparate mit Lufteinschluß, die das Verhalten der Knochenlacunen und ihrer Kanälchen zeigen sollen. Da die wichtigste Vorbedingung für die Haltbarkeit der Präparate ihre Trockenheit ist, so sei im Hinblick auf das oben empfohlene Feuchtschneiden darauf hingewiesen, daß so hergestellte, an der Luft getrocknete Schnitte in Canadabalsam nach längerer oder kürzerer Zeit mehrfach trübe wurden; an Präparaten, die ^j.^ Stunde in XXII, 1. Arndt:" Technik u. Methodik d. mikroskopischen Doppelsäge, m absolutem Alkohol (im Brutschrank bei 37 "), dann kurze Zeit in Äther zuiiTbracht hatten und nach dessen Verdunstung in flüssig ge- machten Canadabalsam eingebracht worden waren, ist Trübung nicht beobachtet worden. Zur Konservierung von Schnitten, die nicht so- fort mikroskopiert werden sollen, ferner zum Studium von Struktur- und Übersichtsbildern, Einschlüssen der knöchernen Hohlräume ist der Grly zerineinschliiß an die erste Stelle zu setzen. Völlig säure- freies Glyzerin dürfte im Handel kaum zu haben sein ; für die Gefahrlosigkeit des sehr geringen Säuregehaltes spricht jedenfalls der Umstand, daß zahlreiche Knochen- und Zahnpräparate, die ich seit vier Jahren in Glyzerin eingeschlossen aufbewahre , keinerlei Spuren von Säurewirkung zeigen. Schnitte von macerierten Knochen werden vom Glyzerin weit schneller aufgehellt als solche von frischen oder feucht konservierten. Dicke Übersichtspräparate der letzteren Art können schneller aufgehellt werden, wenn man die Schnitte vom Wasser (das Abpinseln des Sägemehls geschieht am besten unter Wasser) nicht direkt in Glyzerin, sondern zunächst für einige Stunden in eine Mischung von Wasser und Glyzerin zu gleichen Teilen bringt und auch des weiteren, bis zum Verbringen in reines Glyzerin, den Glyzerinanteil der Mischung nur allmählich steigen läßt. Was das Anwendungsgebiet der Doppelsäge betrifft , so lag mir ihre Nutzbarmachung für das Gebiet der pathologischen Anatomie besonders nahe. Hierbei zeigte sich, daß auch von solchen Objekten, deren lockeres Gefüge die unmittelbare Bearbeitung auf dem Schleifstein gänzlich ausschließt oder nur in beschränkter Größe zuläßt, mit der Doppelsäge noch große Übersichtsschnitte gelangen. Als Beispiel eines Objektes von ungleichartigem , teilweise lockerem Gefüge können die Knochen des Schädeldaches dienen ; schneidet man solche frischen oder feucht konservierten Schädelknocheu, deren Markhypertrophie vermehrte Knochenbildung vortäuschte , so wird, wer mit Vorsicht gesägt hatte, oft überrascht durch die Beobachtung, daß selbst weitmaschige Netzwerke von feinsten Spongiosa-Bälkchen meist erhalten geblieben sind. Auch von solchen pathologischen 01)jekten, bei denen eine Abnahme des Kalkgehaltes, wie bei osteo- malacischen Knochen, oder eine hochgradige Auflockerung sämtlicher Lamellensysteme, nebst Erweiterung und Deformierung der Havers- schen Kanäle und ausgedehnte Volkmann sehe Kanalikulation im Vordergrund standen, wie ich sie in einem Falle von Akromegalie^ ^) Worüber an anderer Stelle berichtet werden soll. 112 Arndt: Technik u. Methodik d. mikroskopischen Doppelsäge. XXII, 1. und — teilweise — an Sequestern osteomyelitischen Ursprungs reicH- lich beobachten konnte, ließen sich unschwer instruktive Quer- und Längsschnitte anfertigen. Zur Gewinnung e n t k a 1 k t e r Knochenpräparate war die Doppel- säge mehrfach in denjenigen Fällen von Nutzen, wo eine beschleu- nigte Untersuchung erwünscht war. Man schneidet bei hoch- geklappter Stellvorrichtung Knochenplättchen von ca. 0*3 bis 0*5 mm Dicke ; solche Plättchen sind leicht in großer Ausdehnung auch von stark spongiösem Material zu gewinnen ; sie können in kurzer Frist entkalkt und in Celloidin eingeschlossen oder gleich auf dem Gefrier- mikrotom geschnitten werden. Ist für einen genau ebenen Einschluß und richtige Orientierung gesorgt worden , so läßt sich immer eine Anzahl feiner Mikrotomschnitte gewinnen, die in der üblichen Weise weiter behandelt werden. c. Sehraubkluppe. Der Mangel an brauchbaren Vorrichtungen zur sicheren Be- festigung sehr kleiner oder platter oder zarter Objekte zwecks Be- arbeitung mit der Doppelsäge machte mir die Konstruierung eines Hilfsmittels nötig, das technisch zur Gruppe der „Kluppen" gerechnet werden kann, seiner Form nach aber sich weit von ihnen entfernt und daher besonders beschrieben sei: p]in kräftiger schmiedeeiserner Arm a (Fig. 5) von 12 cm Länge geht an dem einen Ende in den viereckigen länglichen Kasten a^ über, an dessen Stirnwand das Abflußrohr k fs. o.) angebracht ist. Der Innenraum des Kastens wird größtenteils von dem aus weichem Holz gefertigten Holzblock g eingenommen, dessen rauher Querschnitt horizontal liegt und den oberen Kastenrand um 0'5 cm überragt. Die auf der anderen, auf der Figur nicht sichtbaren Seitenfläche des Kastens angebrachte , punktiert gezeichnete Schraube h dient zur Befestigung des Blockes. Der vom Boden des Kastens ausgehende Fortsatz f kann in Schraubstöcke beliebiger Art und Größe horizontal eingespannt werden. Das andere Ende des Armes a ist durch ein Scharniergelenk c mit dem beweglichen Arm h verbunden, der durch eine mit breitem, kräftigem Flügelgriff versehene Schraube e, ent- gegen dem Widerstand einer Feder d^ dem festen Arm a genähert werden kann. Das freie Ende des Armes b reicht bis zur Mitte des Blockes g^ ist abgeplattet, stark verbreitert und an seiner Unterfläche XXII, 1. Arndt: Technik u. Methodik d. mikroskopischen Doppelsäge. 113 gezähnt. Die Zahniuig verhindert auch ohne Anwendung starken Druckes, daß ein zwischen b und den Holzblock g festgespanntes Objekt / beim Sägen (die Schnittstelle ist durch einen Pfeil ange- deutet) seitlich ausweicht. Der Holzblock kann natürlich beliebige Form erhalten, am einfachsten lassen sich weiche Celloi'dinklötze zu- stutzen ; für Schnitte von schmalen, rundlichen oder hochkantigen Objekten, z. B. Querschnitte von jugendlichen Röhrenknochen, wurde der Holzblock mit einer längs, in der Ebene der Zeichnung, ver- laufenden Rinne versehen, in der das Objekt mit großer Sicher- heit und Schonung gegen seitliche Verschiebung durch den Arm b festgehalten wird. Die Holzunterlage gestattet, was besonders an Querschnitten von platten Objekten , z. B. Knochenplatten der Dura mater , angenehm empfunden wird , auch die untersten Schichten des Objekts mit in den Bereich des Schnittes zu ziehen; der Holzblock wird dabei zwar mitgeschnitten , schädigt aber die Sägen nicht. Herstellung und Vertrieb der neuen Doppelsäge und Schraub- kluppe erfolgt wie bisher durch die Fabrik chirurgischer Instrumente von J. Thamm in Berlin NW., Karlstraße 14. [Eingegangen am 17. Februar 1905.] Zeitschr. f. wiss. Mikroskopie. XXII. 1. ]^14 Metz: Die Leitzsclie Dunkelfeldbeleuchtung. XXII, 1. Die Leitzsche Dunkelfeldbeleuchtung bei Verwendung der homogenen Olimmersion. Von Carl Metz in Wetzlar. Hierzu vier Holzschnitte. Nach der Einführung eines Beleuchtimgsapparates am Mikroskop, bestehend aus Spiegel und Kondensorlinsen, welchen wir den Eng- ländern WoLLASTON, GoRiNG lind Brewster verdanken, findet sich schon eine von Reade um 1837 angegebene Einrichtung für Dunkel- feldbeleuchtung erwähnt (s. Hakting-Theile, Das Mikroskop, 2. Aufl., I, p. 245). Eine Reihe von Vorrichtungen zur Erzielung der Dunkelfeld- beleuchtung findet sich in der Folge erwähnt. Am meisten führten sich die Zentralblenden ein. Es wird durch diese bekanntlich der zentrale Teil des Kondensors bis zur Öff"nung des Objektives abgeblendet und die Beleuchtung durch die Randstrahlen des Kondensors, deren Apertur höher ist als die des Objektives, bewirkt. Ein Eindringen der direkten Lichtstrahlen in den Bildraum bleibt dadurch aus- geschlossen. Diese Blendung war zulässig, solange man nur mit Trockensystemen arbeitete , deren Apertur wesentlich kleiner ist als die des Kondensors. Anders verhält es sich , wenn man sich der Olimmersion bedient. Die Apertur dieses Objektives und die des gebräuchlichen Kondensors ist gleich. Es bieten sich zwei Wege, eine Dunkelfeldbeleuchtung bei Anwendung der Olimmersion zu er- zielen. Entweder benutzt man einen Kondensor von erheblich höherer Apertur als 1*30 und blendet die zentralen Lichtbündel bis zu der Apertur der Immersion ab, oder man verzichtet auf einen Teil der Oifnung der Immersion und benutzt die ausgeschaltete Apertur des Objektivs zur Beleuchtung. Es lassen sich hierzu zwei Wege ein- schlagen: man benutzt die höhere Apertur zur Beleuchtung und bedient sich des inneren zentralen Lichtkegels zur Beobachtung (s. diese Zeitschr. Bd. XV, 1898, p. 289 ft'.), oder man beleuchtet XXII, 1. Metz: Die Leitzsche Dunkelfeldbeleuchtuni?. 115 mit einem inneren Lichtkegel und schaltet ihn bei der Beobachtung aus. In dieser Weise ist die hier mitgeteilte, in der optischen Werk- stätte von E. Leitz in Wetzlar ausgeführte , Einrichtung zustande gekommen. Da das Licht der Sonne oder einer Bogenlampe von nicht unter 8 Ampere Stärke zur Verwendung vorgesehen ist, so kann der innere Beleuchtungskegel dünn werden : eine starke Abbiendung des Objek- tives und ein größerer Verlust an auflösender Kraft wird dadurch nach Möglichkeit vermieden. Den einen Bestandteil der neuen Duukelfeldeinrichtung bildet der eigene Beleuchtungsapparat (s. Fig. 1), welcher an Stelle des 1. Dunkelfeld-Beleuchtungsapparat. 2. Objektiv mit Stempelblende. gewöhnlichen Beleuchtungsapparates in dessen federnde Hülse unter dem Mikroskop eingesteckt wird. Das Beleuchtungssystem ist eine achromatische Doppellinse von 9 mm Brennweite und 4 mm Öffnung, welche dem Üffnungswinkel von 24^ entspricht. Die obere Planfläche des' Beleuchtungssystems sitzt 7 mm unter der Objektebene , so daß letztere mit dem oberen Brennpunkt des Beleuchtungssystems zusammenfällt. Unter dem Kondensor sitzt eine Blendscheibe mit den Blenden- öffnungen von 0'5, 1*0, 1*5 und 2"0 mm. Nach der Wahl dieser Öft'nungeu beträgt der Öffnungswinkel des Beleuchtungskegels 6, 12, 18 und 24 Grad. Durch eine Zentriervorrichtuug wird der Beleuchtungsapparat genau auf die optische Achse eingestellt. 8* 116 Metz: Die Leitzsche Dunkelfeldbeleuchtung, XXII. 1. Durch den Hohl- oder Planspiegel wird das Licht der Sonne oder einer Bogenlampe dem Kondensor zugelenkt. Der zweite wesentliche Bestandteil der Dunkelfeldeinrichtung ist die Blende (Fig. 2) , welche die Gestalt eines kleinen Stempels be- sitzt und sich auf den zentralen Teil der hinteren Linse des Öl- immersions-Systems aufsetzt. Dieser Stempel, dessen untere Fläche einen Durchmesser von 1"75 mm besitzt, wird in der Achse eines kleinen Zylinders mittels zwei über Kreuz laufender Drähtchen ge- halten. Dieser Zylinder wird an Stelle des Objektivverbindungs- stückes mit dem vernickelten die Linsen enthaltenden Teil des Ob- jektives verschraubt. Die lose in der optischen Achse verschiebbare Blende fällt beim Gebrauch von selbst, vermöge ihres Gewichts auf die hintere Linsenverbindung des Objektives und schneidet allen Schematische Darstellung des Strahlenverlaufes in Blende und Objektiv. zentralen Bündeln bis zu einer (Jffnung von 38^ den Zutritt zum Tubus und Bildraiim ab. Ein solches Bündel — in der schematischen Darstellung (Fig. 3) durch die ausgezogenen Linien veranschaulicht — dient also nur zur Beleuchtung des Objektes. Die bilderzeugenden Strahlenbündel, welche von dem grell be- leuchteten Objekt ausgehen — in Figur 3 durch punktierte Linien bezeichnet — besitzen die ()ffnungswinkel 38 bis 120", denen die num. Aper. 0"5 bis 1*30 entsprechen. Nicht allzu schwierig läßt sich bei richtiger Handhabung des Apparates das von störenden Lichtreflexen freie dunkle Gesichts- feld erzielen. Der scharfe Kontrast zwischen dunkelem Feld und grell leuch- tendem Bilde läßt noch Objekte hervortreten, welche bei gewöhnlicher XXII, 1. Metz: Die Leitzsche Dunkelfeldbeleuchtung. 117 Beleuchtung dem Auge entgehen. Es kann deshalb diese Dunkel- feldeinrichtung, welche der von Siedentopf und Zsigmondy (Annal. der Physik X, 1903, p. 1 — 39) angegebenen Methode verwandt ist, auch zur Erforschung ultramikroskopischer Teilchen vorteilhaft heran- gezogen werden. Auch sonst unsichtbare ungefärbte Bakterien lassen sich durch diese Einriclitung zur Wahrnehmung bringen. Zur Untersuchung ultramikroskopischer Teilchen in Flüssigkeiten, z. B. in Gold- und Silberlösungen, dient eine Kammer, welche Figur 4 im Querschnitt zeigt. Die Einrichtung der Kammer ist folgende: In einer Messingplatte ist eine zylindrische Vertiefung aus- gedreht. Den Boden dieser Kammer, deren Mitte durchbohrt ist, deckt eine Glasplatte. Die Mitte der Glasplatte bildet eine kreis- runde Erhöhung, deren plane und mit der Bodenfläche parallele Ober- fläche etwa 1 mm die Bodenfläche überragt. Zwischen diesem inneren zylindrischen Glaskörper und der Kammerwand ist eine Rinne ge- T -IJ J I 1 ,.__ V WflB^:^ : I j 4. Kaminer zur Untersuchung von Flüssigkeiten, bildet. Das dünne Deckglas von 18 mm Durchmesser, welches zur Bedeckung der -Kammer dient, ist an der unteren Seite eines Ringes, der sich auf die Metallkamraer aufschraubt, mit einer Gummidichtung aufgesetzt. Das verschraubte Deckglas sitzt so auf dem oberen, etwas über der Oberfläche des Glaszylinders erhöhten Metallrand der Kammer, daß zwischen der Unterfläche des Deckglases und der Oberfläche des Glaszylinders sich ein 0"08 mm hoher Raum bildet, der mit der Rinne in Verbindung steht. Von dieser führen zwei Öffnungen, durch welche die zu untersuchende Flüssigkeit zu- und abströmt, nach außen. In dem von dem Dunkelfeldkondensor beleuchteten schmalen Raum zwischen Deckglas und Glaszylinder wird die Untersuchung vor- genommen. Es treten bei der Beobachtung mit der beschriebenen Dunkel- feldbeleuchtung, wie überhaupt bei Anwendung von Duukelfeldbeleuch- tung, leicht stark störende Beugungserscheinungen hervor. Sie lassen sich durch eine passende Wahl der Stelle des Prä- 118 T r i e p e 1 : Ein Zylinder - Rotations - Mikrotom. XXII, 1, parates, in welcher die beleiicliteteu Objekte nicht zu sehr gehäuft auftreten, durch eine günstige Einbettung der Objekte, durch richtige Regulierung und Dämpfung des Lichtes vermindern. Gelingt es durch solche oder ähnliche Mittel Bilder zu erhalten, in denen die sekundären Beugungsbilder gegen das primäre Bild sehr deutlich zurücktreten und letzteres nicht verwirren, so könnte dieser Beleuchtungseinrichtung, mit welcher man bei gewöhnlicher Beleuchtung unsichtbare Objekte zu erkennen vermag, ein günstiges Prognostikon für die Zukunft gestellt werden. [Eingegangen am 19. März 1905.] Ein Zylinder - Rotations - Mikrotom. Von Hermaiin Triepel in Greifswald. Hierzu drei Holzschnitte. Bei den meisten der bisher konstruierten Mikrotome sind Schnitt- ebene des Objektes und gleitende Flächen des Instrumentes so an- geordnet, daß schon die geringste Abweichung von der exakten Bewegung der Gleitflächen nicht unbeträchtliche Schwankungen der erzielten Schnittdicke herbeiführen kann. So bedingt beispielsweise bei Schlittenmikrotomen eine minimale Drehung des Messerschlittens, wie sie leicht beim Schneiden schwieriger Objekte sich einstellt, infolge von Hebelwirkung einen bedeutenden Ausschlag des freien Messerendes. Der Übelstand wird besonders dann fühlbar, wenn sich zwischen den aufeinander gleitenden Flächen eine Ölschicht be- findet, da deren Form veränderlich ist. Die Dicke dieser Schicht schwankt erheblich , sobald der auf ihr lastende Druck nur im ge- ringsten Grade verändert wird. ^ 1) Vgl. Heidenhain, M., Über die Schlittenbremse, eine Neukonstruk- tion am Jung sehen Mikrotom zur Vermehrung der Stabilität der Schlitten- führung (Diese Zeitschr. Bd. XVIII, 1901, p. 138). XXII, 1. Triepel: Ein Zylinder -Rotations -Mikrotom. 119 Ich glaube nun, daß bei dem Zylinder-Rotatious -Mikrotom, das ich im folgenden beschreiben werde, der Einfluß der genannten Fehlerquelle von vornherein durch das Prinzip ausgeschaltet ist, das der Konstruktion des Instrumentes zugrunde gelegt wurde. Es ist bei diesem nur eine einzige gleitende Fläche vorhanden , die so- wohl bei der Hebung des Objektes , als auch bei der Herstellung der Schnitte bewegt wird, so daß die unvermeidlichen Abweichungen 1. von mathematisch-exaktem Gang auf einen einzigen Ort beschränkt sind. Die Schnittebene des Objektes ist nun senkrecht zur Glejt- fläche orientiert, und etwa vorkommende ungewollte Verschiebungen werden daher im wesentlichen nur Verlagerungen des Objektes parallel zur Schnittebene, aber nicht senkrecht zu ihr veranlassen. Das Mikrotom ist nach meinen Angaben in der Werkstätte von Gustav Miehe angefertigt worden. Einige Einzelheiten der Kon- struktion wurden auf Anraten von Herrn F. Bode, des Inhabers der Werkstätte, in den Plan übernommen. J20 Triepel: Ein Zylinder -Rotations -Mikrotom. XXII, 1. Figur 1 zeigt das Mikrotom in (nicht ganzj ^/^ der natür- lichen Größe. Mit einer Grundplatte ist ein auf drei Füßen ruhender stark- wandiger Hohlzyliuder von 107 mm äußerem Durchmesser fest ver- banden. In ihm befindet sich ein zweiter Hohlzylinder, der aus Stahl gefertigt ist, eine Höhe von 115 mm und einen äußeren Durch- messer von 80 mm besitzt und am oberen und unteren Ende durch eine Messingplatte verschlossen ist. Der unteren Verschlußplatte ist noch ein kleines Plättchen aus gehärtetem Stahl aufgeschraubt, mit dem der innere Zylinder auf der Mikrometerschraube steht. Die Stahlkuppe der Schraube ist gleichfalls gehärtet. Im übrigen ist die Hebungsvorrichtung die bekannte ; Drehung der Scheibe um die Breite eines Zahnes bewirkt Hebung des Zylinders um 2 ^i. An der oberen Verschlußplatte des inneren Zylinders ist die Objektklammer befestigt. Das Schneiden geschieht in der Weise, daß der Zylinder mit dem Objekt gedreht wird, während das Messer festgestellt ist. Von den weiteren Einrichtungen des Apparates sind zunächst die beiden Kugellager zu erwähnen, in denen sich der innere Zylin- der bewegt, und die am oberen und unteren Ende des festen Zylinders angebracht sind. Figur 2 stellt in "j^ der natürlichen Größe einen Schnitt durch das obere der beiden Lager dar. Es bedeutet hier a den äußeren, b den inneren Zylinder, c und d sind zwei Stahl- ringe , die in ein an der Innenseite von a gedrehtes Gewinde ein- geschraubt sind. Die Ringe sind an der unteren, beziehungsweise oberen inneren Kante abgeschrägt, und sie begrenzen zusammen mit der äußeren Fläche des inneren Zylinders einen im Durchschnitt dreiseitigen Kanal, der vollkommen mit Stahlkugeln von 4 mm Durch- messer angefüllt ist. Beim Justieren des Instrumentes wird der Ring c dem Ring d nach Möglichkeit genähert und darauf durch die Kontremutter e in der Lage gesichert. Das Messer wird auf einem massiven vierseitigen, nach oben z.u etwas verjüngten Prisma (s. Fig. 1) befestigt, das 23 cm hoch ist und rechts von den Zylindern etwas hinter der horizontalen Mittel- linie steht. Das Prisma trägt an seiner vorderen Seite das Lager, in dem sicli die Achse der Kurbel dreht. Am linken Ende der Achse befindet sich ein aus Hartgummi gefertigtes Zahnrad, und dessen Zähne greifen in vertikal stehende Leisten ein, die an einem den äußeren Zylinder kragenartig überragenden Vorsprung der oberen Verschlußplatte des inneren Zylinders angebracht sind. Bei der XXII, 1. Triepel: Ein Zylinder -Rotations -Mikrotom. 121 durch die Kurbeldrehimg bewirkten Bewegung des Zylinders findet eine Übersetzung von 2 : 1 statt. Der Objekthalter ist so eingerichtet, daß er einmal im ganzen in verschiedene Entfernung von der Zylinderachse gebracht werden kann. (Der Ort der gleitenden Fläche ist durch einen auf der oberen Verschlußplatte eingeschnittenen Kreis bezeichnet.) Ferner können an einem Kreuzstück Drehungen um zwei zueinander senk- recht stehende horizontale Achsen ausgeführt werden, und der Stift der Klammer läßt sich höher und tiefer stellen und um seine eigene Achse drehen. Von den Maßen des Apparates ist noch bemerkenswert, daß die Mittellinien der Kugellager um 74 mm voneinander entfei'nt sind b \ ® Ic n a 3. und die Mitte des oberen Lagers von der durch das obere Ende des Prismas gelegten llorizontalebene (die annähernd mit der Schnitt- ebene zusammenfällt) um 96 mm absteht. Es erscheint geboten , daß man bei einem neukonstruierten Mikrotom die G r i) ß e des übe r h a u p t möglichen Fehlers zu ermitteln sucht und so über die theoretischen Erwägungen Rechen- schaft gibt, die zu dem Bau des Instrumentes geführt haben. Bei dem beschriebenen Zylinder-Rotations-Mikrotom ist — sofern man von einer Deformation der Metallteile absieht — eine Ab- weichung vom mathematisch -exakten Gang nur dadurch möglich, daß der innere Zylinder selbst bei der sorgfältigsten Justierung noch minimale Drehungen um horizontal liegende Achsen ausführen kann. Der Mittelpunkt dieser Drehungen kann in der Zylinderachse 122 Triepel: Ein Zylinder -Rotations -Mikrotom. XXII, 1. und in halber Höhe zwischen den beiden Kngellagern angenommen werden. Beträgt die Drehung des Zylinders um den Punkt M (s. Fig. 3) den Winkel 99, so bewegt sich der Objektpunkt P nach P', d. h. er senkt sich um //, wobei y den gesuchten möglichen Fehler be- deutet. Nennt man r den Abstand des Punktes P von der Zyliuder- achse , d seinen Abstand von il/, h seinen Abstand von der durch M gelegten Horizontalebene , .s die Gerade PP' und )] und q die in den gezeichneten rechtwinkligen Dreiecken den Seiten y bezw. r gegenüber liegenden Winkel, und setzt man QP s '''' T = 2^ = ^'' cos —■ = /»•, so ergibt sich y = s ' sin y = s ■ sin ^-^ -f q^ = s I sin ^ cos Q -|- cos ^ sin ^1 y = 2c ich -j- kr). Es folgt hieraus, daß der mögliche Fehler um so größer ist, je größer r ist, d.h. der Abstand des Objektpunktes von der Zylinderachse. Der Fehler wächst auch mit wachsendem Ä, aber in viel geringerem Grade, da bei den in Frage kommenden Werten von -^ jedenfalls c • ohne weiteres zu. Daß , wenn eine unendliche , periodische , regelmäßige Struktur an Stelle einer konti- nuierlichen Beugungsfigur, wie sie durch eine einzige Öffnung ent- steht, durch das Zusammenwirken aller Öffnungen isolierte Maxima zeigt, diese dann an der örtlichen verhältnismäßigen Lichtstärke und Phase teilnehmeiij dies ist wohl selbstverständlich. Einige Sätze über Zahl und Lage der positiven Nebenmaxima zwischen Zentrum und 1. absolutem Minimum allerdings sind interessant und erscheinen mir für den Augenblick neu. Und so begrüße ich denn die angezeigten hübschen und ver- dienstlichen Experimente als willkommenen Anlaß, Anregung zu geben, daß man auch bei uns — nicht nur in England — sich eifrig mit beugungstheoretischer Optik beschäftige. Möge .man jedoch auch von dem Einsicht nehmen , was schon vorhanden ist ; denn der Rohbau ist im großen und ganzen schon fertig, es wird sich meines Erachtens meist nur um die Ausschmückung einzelner Räume handeln. [Eingegangen am 14. Juni 1905.] Zeitschr. f. wiss. Mikroskopie. XXII, 2. 13 194 Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. XXII, 2. Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie seit Zimmermanns „ Botanischer Mikrotechnik ". Saminelreferat von Dr. Oswald Richter . in Prag. Einleitung. Die ungeahnte Höhe, zu der sich die Mikrochemie als Hilfs- wissenschaft der Botanik aufgeschwungen liatte, veranlaßte 1881 PouLSEN auf Anregung Warmings sein Werkchen „Die botanische Mikrochemie" zu veröffentlichen, die sich als treffliches Hilfs- mittel in der Hand des Botanikers erwies. Zu derselben Zeit beschäftigte sich W. Behrens mit der Redak- tion seines Werkes „Hilfsbuch zur Ausführung mikrosko- pischer Untersuchungen", bei dem er sich als Ziel gesteckt hatte , die „wichtigsten Keaktionsmethoden und die mikroskopische Untersuchung der Pflanzenstoffe" in erschöpfender Darstellung zu bringen. War PouLSENS Werk ein Führer für Anfänger, so sollte dieses dem Fach manne gleichzeitig einen vollkommenen Einblick in die einschlägige Literatur bieten und dadurch zu einem großen wertvollen Hilfsbuche werden. In der richtigen Erkenntnis, daß die Botaniker bei der Unter- suchung der Nahrungs- und Genußraittel das Hauptgewicht auf die Anatomie , die Chemiker aber bloß auf die in den Objekten ge- fundenen Stoffe legten , veranlaßte jMolisch zu einer Verbindung dieser getrennten Standpunkte und wies so der Mikrochemie auch die gebührende Rolle in der Nahrungsmitteluntersuchung zu. Die XXII, 2. Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. 195 liäutige Bezugnalime auf seinen „Grundriß e i n e r H i s 1 c h e m i e der pflanzlichen Genuß mittel" gibt den besten Beleg dafür, wie notwendig dieser Fortschritt war. Somit war seit Poulsen und W. Behrens etwa ein Dezennium verstrichen, während welchem die Mikrochemie immer neue Gebiete eroberte, und die Fülle von Schriften botanisch-mikrochemischen und mikroskopisch-technischen Inhalts, die in den verschiedensten Zeit Schriften veröffentlicht worden waren, hatten das Bedürfnis gezeitigt, sie zusammenfassend und kritisch zu behandeln. In wie ausgezeich- neter Weise Zimmermann dieser schwierigen Aufgabe gerecht wurde, beweist die starke Verbreitung seines Werkes „Die botanische Mikrotechnik" und die große Beliebtheit, deren es sich erfreut. Um dieselbe Zeit baute H. Behrens in Verfolgung der durch K. Haushofers „Mikroskopische Reaktionen" gegebenen Anregungen sein großes System der mikrochemischen Analyse aus, um es 1895 bis 1897 in seiner „Anleitung zur mikrochemischen Ana- lyse" zum Abschluß zu bringen. Daß bei der Fülle von Stoff, der zu bewältigen war, mancher geringe Fehler unterlaufen ist, so z. B. gewisse Reaktionen ohne ge- nügende Überprüfung mit aufgenommen worden sind, tut der Behrens- schen Leistung keinen Eintrag und wird dem Verfasser des großen Werkes den Ruhm nicht nehmen, der Begründer des Systems der mikrochemischen Analyse gewesen zu sein. Es braucht kaum hervorgehoben zu werden , daß Behrens be- sonders bei der Analyse der wichtigsten Faserstoffe der botanischen Mikrochemie gerecht wurde. In kurzen Zügen ist er auf den technischen Teil seiner Aus- führungen im Jahre 1900 in seinem Büchlein „Mikrochemische Technik" zurückgekommen. Inzwischen gab W. Behrens auch ein sehr beliebt gewordenes Buch heraus; seine „Tabellen zum Gebrauche bei mikro- skopischen Arbeiten", das dem Tier- wie dem Pflanzen- histologen gleich wert geworden ist. Kurz sei auch auf Dünnenbergers „Chemische R e a g e n - tien und Reaktionen" verwiesen, die von einem Apotheker für Apotheker und Chemiker geschrieben, durch Aufnahme auch von botanisch- mikrochemischen Reaktionen Interesse für die botanische Mikrochemie gewinnen. Doch speziell mit dieser Wissenschaft bat sich seit Zimmermanns erwähntem Buche kein größeres Werk beschäftigt. 13* 196 Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. XXII, 2. Seit dem Erscheinungsjahre der „Mikrotechnik" war wiederum etwa ein Dezennium verflossen und die inzwischen angehcäufte Literatur hat ein neues großartig angelegtes Werk gezeitigt, dessen Verfasser, vornehmlich Ärzte und Chemiker, ihr Hauptaugenmerk natürlich der Mikrotechnik auf menschen- und tier histologischem Gebiete zuwandten, die aber, um den Einseitigkeitsstandpunkt zu vermeiden, sich auch mit Botanikern in Verbindung setzten und so ein Werk zu schaffen verstanden, das in der mikroskopischen Technik einzig dasteht, die „Enzyklopädie der mikroskopischen Technik" von P. Ehrlich, R. Krause, M. Moose, H. Rosin. Berlin u. Wien (Verlag ürban u. Schwarzenberg) 1903. Den botanischen Teil übernahm W. Magnus, Berlin. Der schlagwortweisen Anordnung der Enzyklopädie entsprach es natürlich , daß auch die botanischen Daten in derselben Weise geliefert wurden, wodurch sie sich wohl harmonisch in den Rahmen des Ganzen fügten , dabei aber sachgemäß ihren inneren Zusammen- hang preisgaben. Da nun W. Magnus' Ausführungen die letzten zusammenfassen- den Erörterungen über botanische Mikrochemie enthalten , so ergibt sich hier eine Lücke — es fehlt ein Sammelreferat für botanische Mikrochemie über die letzten 12 Jahre — , das zu übernehmen, beziehungsweise die auszufüllen ich von dem Herausgeber dieser Zeitschrift gebeten wurde. Eine derartige Literaturzusammenstel- lung über Arbeiten auf dem Gebiete der botanischen Mikrochemie wird um so berechtigter erscheinen, als diese sehr an Bedeutung gewonnen hat. Im Jahre 1867 hat sie Wiesner die Mittel in die Hand gegeben, seine „Einleitung in die technische Mikroskopie" zu schreiben. Und wer heute die im Jahre 1900 erschienene zweite, gänzlich umgearbeitete und erweiterte Auflage seines Werkes „Die Rohstoffe des Pflanzen- reiches" durchsieht und auf die Einleitung, dann gewisse Kapitel wie „Physikalisch -mikroskopisch -chemische Charakteristik des Indigo", „Chemische p]igenschaften der Stärke", „Chemische Charakteristik des Holzes und der andern fibrösen Pflanzengewebe", „Chemische Eigenschaften der Fasern" genauer eingeht, wird von der Bedeutung der botanischen Mikrochemie auch auf dem Gebiet der Rohstoft'lehre und ihrer Bedeutung überhaupt überzeugt sein. — J^ine neue Rich- tung der Wissenschaft, die auch hervorragend durch die Mikrochemie gefordert wurde, ist die Biochemie, wie Czapeks umfassendes Werk beweist. — Man wird daher mein Beginnen, ihre Geschichte seit XXII, 2. Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. 197 Zimmermanns botanischer Mikrotechnik zu schreiben, für gerecht- fertigt halten. Mein Sammelreferat schließt also unmittelbar an Zimmermanns Mikrotechnik an, was sich auch äußerlich darin ausprägen soll, daß ich soweit wie möglich die gleiche f^inteilung verwendet und damit sowohl in sachlicher wie in historischer Beziehung mit meinem Re- ferate eine freilich äußerst unvollkommene Ergänzung dieses Werkes mich zu liefern bemüht habe. Es ist selbstverständlich, daß ich bei der Fülle des Stoffes außer der Bewältigung der Lektüre einiger Arbeiten im Originale mich vornehmlich an Referate und hier wieder besonders an die in dieser Zeitschrift erschienenen gehalten habe. Um nun bei den Besitzern derselben eine rasche Orientierung zu ermöglichen , habe ich auch auf die Stellen in dieser Zeitschrift verwiesen, indem ich den Titel der Arbeit in der Literaturzusammen- stellung nur gekürzt wiederholte. In jenen Fällen natürlich , wo eine Besprechung in ihr noch nicht erfolgt ist, und in jenen, wo ich mich auf Seitenzahlen zu beziehen hatte, wurde die Arbeit aus- führlich zitiert. Nachdem ich so die Gedanken, die mich bei Verfassung meines Referates geleitet haben, und den Vorgang, an dem ich bei der Niederschrift festhielt, erörtert habe, übergebe ich es der Öffentlich- keit und bitte die geehrten Fachgenossen um gütige Nachsicht. I. Abschnitt : Anorganische Verbindungen. Sauerstoff O.,. f. Als empfindlichstes bisher bekanntes Reagens auf Sauerstoff gilt die Engelmann sehe Bakterien- Methode. Fast scheint sie aber übertroffen durch den von Beijerinck an- gegebenen Sauerstoffnachweis mittels Leuchtbakterien. Zieht man in einer Eprouvette mit chlornatriumhaltiger Fleischbouillon Leucht- bakterien, so zeigt sich, daß sie nur oben leuchtet, dort, wo die Bakterien unmittelbar mit der Luft in Berührung kommen, tiefer unten verlischt infolge des durch Atmung erzeugten Sauerstoffmangels 198 Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. XXII, '2. (las Leuchten der geschüttelten Eprouvette alsbald. Wirft man ein ZweigstUck von Fucus in die Bouillon und wartet im Dunkeln das Dunkelwerden am Eprouvettengrunde ab, so genügt nachher das Licht eines Streichhölzchens , um das Fucusfragment zum Leuchten im Dunkeln zu veranlassen. Der Moment der Beleuchtung hat genügt,. um die Kohlensäureassimilation zu induzieren. Und jene Spur ab- geschiedenen Sauerstoffes reicht aus, um die Bakterien zum Leuchten zu bringen. — Beijerinck hat diese Methode später zur Unter- suchung der Chlorophyllfunktion benutzt und Moliscu sie zum Nach- weis postmortaler Assimilation bei Lamium album- Blättern verwendet. Das Problem der Assimilation hat auch Kohl die alte Bläschen- zählmethode in eine neue mikroskopisch verwendbare umsetzen lassen. Er nennt die Modifikation: die vol u m e tr is ch e B las ch en z ä h 1- methode. Eine geeignete Versuchsanstellung gestattet nämlich, die Durchmesser der sich bildenden Bläschen sofort abzumessen , wo- durch die Möglichkeit auf das Volumen zu schließen, unmittelbar gegeben ist. Zumeist findet der Sauerstoff in physiologischer Beziehung Er- wähnung. Molisch und Lidforss beweisen die Notwendigkeit von Sauerstoff zum Auskeimen des Pollens und Molisch, daß die Pollen- schläuche nur eine ganz bestimmte 0-Spannung lieben und vor dem Sauerstoff der Luft fliehen („negativer Aerotropismus"). Im übrigen vergleiche man die übliclien Lehrbücher. Schwefel S. Nach H. Behrens wird der Schwefel als Calciumsulfat, als Caesiumalaun und als Bleisulfat nachgewiesen. Es wird wohl ein- mal notwendig sein, die Verwendbarkeit dieser mikrochemischen Methoden für den Nachweis des Elementes in der Pflanze darzufun. Bekanntlich erscheint der Schwefel in elementarer Form bei den Schwefelbakterien. In zusammenfassender Darstellung findet man unsere derzeitigen Kenntnisse dieser Organismen in dem ,, Handbuch der technischen Mykologie" unter dem Titel „Der Kreislauf des Schwefels" von W. Omelianski wiedergegeben. — Einen neuen Schwefelorganismus hat Hinze in der Thiophysa volutans entdeckt. Die in den Zellen der Thiophysa gelegenen Körnchen bestehen ebenso wie die der Beggiatoa aus Schwefel. In reinem Glyzerin kristal- lisiert der Schwefel allmählich in monuklinen Kristallen aus. In entschwefelten Thiophysen scheinen Schwefelbildner sichtbar zu wer- XXII, 2. Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrocheraie. 199 den. Auch bei OsciUarien konnte Hinze einen sehr beachtenswerten Befund verzeichnen, der auf die „Gasvakuolenfrage" ein Streiflicht wirft. Hinze hat nämlich bei gewissen OsciUarien diese ,,Gasvaku- olen" als Schwefel erkannt, den er in reinem Glyzerin zur Kristal- lisation brachte. P"'ärbung des Schwefels. Gibt man nach A. Fischer ein Präparat von Chromatium ohne vorherige Entschwefelung und Fär- bung in Kanadabalsam oder Damarlack, so sind die Chromatien nach 10 Minuten entfärbt und statt des Schwefels sind schön rotgefärbte Kugeln und Körnchen da. Bei Betrachtung in Luft war Schwefel und Farbstoif getrennt vorhanden. GoLA verwendet die Rotfärbung, die Schwefel mit Nitroprussid- natrium gibt, auch fiir mikrochemische Zwecke. Besonders junge Triebe von Asparagus sollen fiir derartige Untersuchungen sehr ge- eignet sein. Salzsäure HCl und deren Salze. Die gebräuchlichsten Reaktionen auf Chlor führen zu den Fällungen als Thallo- und Silberchlorid und Thallo- und Kaliumchloroplatinat. Davon sind in die botanische IMikrotechnik bis jetzt die ersten zwei mit Erfolg eingeführt worden. In neuerer Zeit hat Molisch die Milchsäfte mit den gleichen Reagentien auf Chlorgehalt untersucht und sie je nach den Ver- suchsobjekten sehr verschieden reich an diesem Stoffe gefunden. Chlor- kaliumkristalle erzielte Monteverde. Jod-J. Durch eigenartige Zellen von Bonnemaisonia asparagoides wird nacli GoLENKiN freies Jod oder eine stärkebläuende Jodverbindung ausgeschieden ; diese Zellen enthalten eine große stark lichtbrechende Vakuole, welche nach ausgeführten Reaktionen weder Gerbstoffe, noch fettartige Stoffe ent- hält. Hingegen färben sich die Vakuolen mit C^anin intensiv braun. Dieses bildet mit Jodlösungen einen braunen in Wasser ziemlich schwer löslichen, unbeständigen Niederschlag. Golenkin glaubt damit ein für botanische Zwecke sehr gut verwertbares mikrochemisches Reagens auf Jod angegeben zu haben. Ich kenne nun zwar diese Reaktion weiter nicht, weiß auch nichts von ihrer Empfindlichkeitsgrenze, möchte aber doch denken, daß, so lange Reaktionen, die auf Bildung von Jodaraylum, Thallo-, Silber-, Pallado-, Mercurijodid und Kaliumjodoplatinatbildung beruhen, existieren, man niclit zur Jodcyanin('?)bildung Zuflucht nehmen sollte, um so mehr als in der Mikrotechnik (man vgl. das Kapitel: „Verkorkte Membranen") dem zur Reaktion verwendeten Cyanin ja noch eine Unzahl anderer Funktionen zukommen. 200 Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. XXII, 2. Schwefelsäure SO., (OH), und deren Salze. Zum Nachweise der Schwefelsäure fehlt es auch heute noch an einer zuverlässig-en Methode. Über den Nachweis mit Baryumchlorid und Stron- tiumnitrat und als Kaliumsulfat und Natriumsulfat, vgl. Z. M. ^, p. 48. Belzung und Poirault haben sie im ausgepreßten Safte von Angio- pteris evecta nachgewiesen. Salpetersäure NO, OH, salpeterige Säure NO OH und deren Salze. Während der Einwand, den man gegen Molisch s Dipheny- laminschwefelsäure - Probe machen könnte, die Nitrite würden mit ihr gleichzeitig angezeigt , für die Pflanze wegen des vollstän- digen Fehlens dieser letzteren in ihr kaum in Betracht kommt, ist ein zweiter, daß in verholzten Membranen die Nitratprobe auch bei großer Menge Nitrates ausbleiben kann, unangenehmer. Ellram hat sich nun dem mikrochemischen Nachweise der Nitrate in Pflanzen gewidmet, um speziell die wertvolle Dipheuylaminprobe nach dieser Ptichtung zu überprüfen. Wie bekannt, hat Arnaud und Pade salzsaures Cinchouamiu (C\g H.-,^N.^O) als neues Nitrat- reagens empfohlen. Für den mikrochemischen Nachweis von Nitraten in Pflanzen hat nach Ellram s Kontrollversucheu das neue Reagens gar keinen Wert. „Die von Molisch empfohlene Diphenylaminschwefelsäure ist nicht nur das empfindlichste Reagens auf Nitrate überhaupt, sondern auch in Verbindung mit Ellram s Ligninreagens das nach allen Richtungen hin am meisten genügende und unter allen Umständen praktisch brauchbarste Reagens für den mikrochemischen Nachweis bei pflanzenphysiologischen Forschungen. Alle andern Methoden sind minderwertig. Lösungen von «-Naphthol, /S-Naphthol und Cinchonamin in konzen- trierter Schwefelsäure sind recht empfindliche Reagentien auf Nitrate und Salpetersäure, lassen sich aber bei phytophysiologischen Untersuchungen kaum mit Nutzen verwerten. Außer in verholzten Geweben ist bei pflanzenphysiologischen Unter- suchungen mit Diphenylaminschwefelsäure eine eventuelle Beeinträchtigung der Oxydation des Diphenylamins vermittels vorhandener Nitrate (Salpeter- säure) durch reduzierende Wirkung der in den betreffenden Gewebearten vorhandenen oder etwa sich bildenden Stoffe entweder ausgeschlossen oder für die Beobachtung der Reaktion selbst praktisch genommen un- wesentlich. ^) Z. M. = Zimmermanns Mikrotechnik. XXII, 2. Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. 201 In vollkommen verholzten Geweben typischer Holzgewächse können sich Nitrate befinden, die sich dann mittels der Diphenylaminschwefelsäure nachweisen lassen nach vorgenommener Ligninreaktion mit dem Diphe- nylaminligninreagens." ^ Ein neues Reagens auf Salpetersäure verdanken wir R. Brauns. Behandelt man einen Tropfen der Lösung, in der man ein Nitrat ver- mutet, mit einem Tropfen Baryumclilorid und erwärmt man auf dem Wasserbade, so scheiden sich aus der nitratlialtigen Lösung farblose, scharf ausgebildete reguläre Oktaeder von Baryumnitrat aus, die meist auf einer Oktaedertiäche liegen, w^eshalb sie dreiseitige oder sechs- seitige Umrisse zeigen. Ob sich diese Reaktion auch für phytophysiologische Versuche wird verwerten lassen, wird die Zukunft zeigen. Über andere Arten des Nachweises vergleiche H. Behrens, A. z. m. A."- p. 118 — 115. Es ist selbstverständlich, daß alle von H. Behrens angegebenen Methoden in ihrer Verwendbarkeit für die Pflanzen erst überprüft werden müssen. Bisher bleibt nach Ellram s Befunden die Diphenylaminschwefelsäure das zweckmäßigste Nitrat- reagens. Es hat daher auch in allen Handbüchern Aufnahme ge- funden. Von neueren Experimenten mit dieser Probe möchte ich das negative Resultat erwähnen, das Molisch bei Milchsäften zumeist er- hielt. Bezüglich Auftretens von Kaliumnitrat in kristallisierter Form vergleiche man Zimjiermanns Mikrotechnik p. 50 und das im Kapitel „Kalium" darüber Erwähnte. Phosphorsäure PO (OH)^ und deren Salze. Zum mikrochemischen Nachweis von Phosphorsäure werden be- sonders Salpetersäure mit molybdänsaurem Ammon und Magnesium- sulfat mit Chlorammonium verwendet. Beide haben sich auch in der botanischen Mikrochemie bewälu't, freilich fehlt beiden der Vorzug der lokalisierten Fällung des gesuchten Stoffes. Diesem Mangel hofften nun Lilienpeld imd Monti mit molyb- dänsaurem Ammoniak und Pyrogallol abzuhelfen. Jedoch haben Raciborskis kritische Nachprüfungen gezeigt, daß Lilienpelds und ^) Der unter Anführungszeichen gestellte Absatz ist entnommen dem Referate von E. Roth (Halle) im Bot. Zentr. Bd. LXVII, 1896, p. 74. -) A. z. m. A. = Anleitung zur mikrochemischen Analyse. 202 Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. XXII, 2. MoNTis angebliche Farbenreaktion auf Phosphor mit dem Phosphor in keinem Zusammenliange steht, und somit aus der mikrochemischen Literatur gestrichen werden muß. Kurze Zeit nach Raciborskis kritischem Referate versuchte PoLLACci eine neue Farbenreaktion auf Phosphorsäure für Pflanzen- untersuchungen einzuführen. Er bringt Schnitte von frischem oder Alkohol-Material unter Benutzung von mit Platinspitzen versehenen Pinzetten in eine Lösung von molybdänsaurem Ammoniak , wäscht dann wiederholt mit neutralem, oder besser mit durch Salpetersäure angesäuertem destilliertem Wasser aus und überträgt scliließlich in Zinnchlorür. Bei Anwesenheit von Phosphor entsteht dann eine dunkelblaue bis graue Färbung, die nach Ansicht Pollaccis auf der Bildung von Molybdänsesquioxyd (Mo., O3) beruht. Bei Ge- weben , die sehr reich an Phosphor sind , muß eine verdünnte Lö- sung von Zinnchlorür augewendet werden. — Die so erhaltenen Prä- parate sollen ihre Färbung in Glyzerin oder auch in Wasser sehr gut behalten, während bei den nach der Methode von Lilienfeld und MoNTi dargestellten Präparaten eine Konservierung in Glyzerin nicht möglich ist. Außerdem soll Pollaccis Reaktion empfindlicher sein. Man könne mit ihr beweisen, daß in den reproduktionsfähigen Organen und hier wieder in den Chromatinkörnern des Kerns der Hauptsitz der Phosphorsäure sei. Auf eine Bemerkung Fioris hin, daß das PoLLACcisclie Reagens (Molybdänsäure und Zinnchlorür) in gerbstofthaltigen Zellen, speziell in dem „sistema albuminosa tannico" nicht zu verwenden sei, führt PoLLAcci in einer späteren Mitteilung den Beweis, daß es sich in diesem Falle um vollkommenen Mangel an Phosphor in den betref- fenden Zellpartien gehandelt habe. Als eine Art Abschluß kann man nach dieser Richtung seine Besprechung der Methoden des mikrochemischen Nachweises von Phosphor in Pflanzengeweben ansehen. Daß es an Gegnern nicht gefehlt hat, ist selbstverständlich, nachdem beispielsweise Xanthoproteinsäure mit Zinnchlorür allein in ähnlicher Weise reagiert wie Phosphorsäure. Auch sollen sich Lecithin- und Nukleinphosphor der Reaktion entziehen. Pollacci hält gegen alle Einwände seine Probe aufrecht. Er gibt ein genaues Rezept an, mit dem man besonders günstige Resultate erzielt, weist auf die Wichtigkeit gründlichen Auswaschens nach Einwirkung des Reagens hin, verwirft den Einwand von der Blaufärbung der Xantho- proteinsäure mit Zinnchlorür auf Grund neuerlicher Untersuchungen, XXII, 2. Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. 203 redet der Verwendung des Zinnchloriir das Wort, — „man kann es nicht nur, soll es beibehalten, da dadurch die Empfindlichkeit der Reaktion ganz außerordentlich gesteigert werde'^ — kurz: Pollaccis Reaktion ist gut und bleibt verwendbar, solange sich keine neuen Gegner finden; sie lautet: Molybdänreagens, dann Waschen in sal- petersaurem Wasser und darauf Behandlung mit Zinnchlorür. Auf einem ähnlichen Prinzipe beruht MacCallums Blaugrün- färbung der phosphorhaltigen Zellen. Nach seinem Vorschlage wird der Phosphor aus in Alkohol gehärtetem Material mit salpetersaurem Molybdänammon gefällt und in einprozentiges Phenylhydrazinhydro- chlorid übertragen. Die phosphorhaltigen Zellen werden alsdann bläulichgrün. Bei Cyanophyceen und bei Hefezellen wurde so der Phosphor nachgewiesen. Es scheint nun auffällig , daß Iwanoff nur die in Z. M. ange- gebenen Reaktionen genau in ihrer Anwendbarkeit iÜr die Pflanzen- untersuchung überprüft hat. Er findet, daß sich beide in ergänzender Art verwenden lassen, indem in Fällen, wo mit dem Molybdat Mohl, mit der Magnesiummischung keine Fällung auftritt, auf organische Phosphorverbindungen geschlossen werden kann. Gibt irgendwo Magnesiumsulfat und Chlorammonium weder die schönen Tripelphos- phatkristalle , noch elliptische Körner , so sei dies ein Hinweis auf eine Bindung von Phosphor an Eiweiß. Die Mehrdeutigkeit beider Reaktionen käme bei Pflanzen nicht in Betracht, da die Möglichkeit einer Arsenausfällung für Ptlanzen nicht zu fürchten ist, und dort, wo gewisse organische Verbindungen die Molybdänprobe unmöglich machen, die Phosphorsäure durch die Magnesiummischung immer noch nachgewiesen werden könne. Vorkommen. Belzung und Poirault weisen Phosphorsäure im ausgepreßten Safte der Angiopteris evecta nach. Die Fällung als Magne- siumammoniiunpliosphat war wegen der gummiartigen Substanzen kugel- förmig; Belzuxg fand in kaktusartigen Euphorbien Culciummalophosphat. Zijimerjiann hat die Calciumphosphatausscheidungen in lebenden Zellen genauer untersucht. Aus Hansens und Leitgebs Untersuchungen über Sphärokristalle hatte sich ergeben, daß die in Alkoholmaterial auftreten- den Spliärite häufig aus Calciumphosphat bestehen. In lebenden Pflanzen wurden nur von Nobbe, Hänlein und Councler derartige Sphärite nach- gewiesen. Zimmermann hat solche Calciumphosphatsphärite bei einer nicht näher bestimmten Cyperus-Art gefunden. Um einen zentralen organischen Teü bildet sich hier der Sphärit. Der Nachweis gelang mit molybdän- saurem Ammoniak in salpetersaurer Lösung, durch Lösung in öprozentiger Essigsäure und durch Erzeugung von Magnesiumamraoniumphosphat. — Die Lilienfeld sehe Reaktion erscheint vermieden. — Re berichtet von 204 Richter: Die Fortseliritte der botanischen Mikrochemie. XXII, 2. Sphäriten bei Agave americana, die Calcium und Phosphor mit organischer Substanz enthalten. Heinricher findet, daß beiden Arten von Lathraea, die er unter- suchte, das reichliche Vorkommen von Phosphorverbindungen gemeinsam sei, die in Alkoholmaterial in der Form kugeliger Ausscheidungen von wechselnder Größe ausfallen. Sie sind im wesentlichen lokalisiert im unteren Teile des Tracheidenkopfes. Die Ausscheidungen sind organischer Natur, da sie beim Glühen einen kohligen, kugelförmigen Rückstand lassen. Magne- sium fehlt ihnen wahrscheinlich und Calcium sicher, der Nachweis erfolgte nach Z. M. ; für die Molybdänprobe wurde erwärmt. Auch Molisch ver- wendete bloß diese Methoden des Phosphorsäure-Nachweises. Nach seinen Befunden ist der Phosphor in Milchsäften in organischer Bindung vorhanden. Färbung der Calciumphosphatsphärite in Pflan- zen. Bringt man Calciumphospliatsphärite in Farbstofflösungen, so speichern die im Inneren eingeschlossenen Schleimkerne nach H. Fischer den Farbstoff. Arsen As. Indem ich auf den Nachweis von Arsen und Arsensäure in H. Behrens' A. z, m. A. verweise, mache ich noch auf die physiologische Art des Arsennachweises aufmerksam, die Plato und Guth mit Penicillium brevi- caule bei 22 bis 30** C. gelang. Das Penicillium wuchs auf Agarplatten mit einem Zusatz von einem Teil Arsen zu 50000 Teilen Agar. Bei seiner Entwicklung erzeugte der Pilz einen intensiven Geruch nach Knoblauch, der auf das vorhandene Arsen deutet. Kohlenstoff- C. Ein ausgezeichnetes Reagens auf reinen Kohlenstoff verdanken wir Wiesner, dem es gelungen ist, mit Hilfe der von Crüger in die Mikro- chemie eingeführten „Chrom-Schwefelsäure" die verschiedenen Formen der Kohle voneinander zu unterscheiden und das Lungenpigment als Rußkohle zu erkennen. Kohlensäure CO.. Nestler weist mit der bekannten mikrochemischen Methode, Zusatz von Salzsäure, in dem Sekretwasser -Rückstand von Phaseolusblättern kohlensaures Kali nach. Rechinger konnte das Vorkommen von Calciumkarbonat in Gesneria- ceenhaaren dartun. Kieselsäure SiO., und Silikate. Glühen, Schwefelsäurebehandlung, Miliarakis Verfahren, Lösung in Flußsäure und Bildung von Kieselfluornatriumkristallen stellen XXII, 2. Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. 205 heute noch als vorzügliche Methoden zum Kieselsäurenachweis im Gebrauche. Ob auch die Bildung von Rubidiumsilicomolybdat sich für botanische Zwecke eignen wird, muß erst die Zukunft lehren. In neuerer Zeit hat sich Küster eingehend mit dem Nachweise der Kieselsäure in der Pflanze beschäftigt und gefunden, daß Kiesel- körper und verkieselte Membranen durch Aufhellung mit Benzol, Chloralhydrat und Phenol nachgewiesen werden können. Besonders zuverlässig ist der entstehende rötliche oder bläuliche Glanz. Am geeignetsten erwies sich bei dieser Probe zunächst das Phenol. Bei seinen späteren Studien über Chrysobalaneen zog er auch das Ver- halten der Kieselablagerungen dieser Pflanzen gegen Farbstofl"e mit in Betracht und fand, daß gewisse Formen sich analog wie Tabaschir verhalten. Sie speichern Gentianaviolett und Methylenblau. KtJSTER erwähnt übrigens auch eine interessante Beobachtung Ajibronns über das Braunwerdeu von Tabaschir in blauen Jodlösungen von Chloro- form oder Schwefelkohlenstoft". Chrysobalaneenkieselkörper zeigen diese Reaktion nicht. Es erübrigt nur noch über bekannt gewordene neue Vorkommen zu referieren. Zimmermann teilt einen Fund in den Blättern von Cyperus alternifolius mit. Hier finden sich eigenartige, meist halbkugehg in den Innenraum der Zellen hineinragende Verdickungen, bei deren näherer Untersuchung sich ergab, daß sie mit Kieselsäure durchsetzte Membran- verdickungen darstellen, bei denen die Kieselsäure in einem Zellulosegerüste sitzt, was mit Flußsäure nachgewiesen werden kann. Rechinger erwähnt Kieselsäure in den Haaren der Gesneriaceen. Beachtenswert ist auch der Befund Bargaglis von intrazellulären Kieselsäureabsonderungen. Kalium K. Die gebräuchliche Reaktion mittels Platinchlorid hat sich auch bei den neueren Untersuchungen Czapeks bewährt. Bei Wurzelausschei- dungen ist es nach Czapek am besten, die zu prüfende Flüssigkeit lang- sam verdunsten zu lassen, dann einen Tropfen des Reagens zuzusetzen und das Deckglas aufzulegen. Auch Nestler bediente sich dieser Reak- tion. Nach seinen Beobachtungen erscheint es zweifellos, daß im Sekret- wasser der Bohnenblätter kohlensaures Kali vorhanden ist, Kaliumnitrat beobachtete Monteverde. Ebenso gelang ihm die Erzeugung von Chlor- kaliumkristallen. Ähnlich erzielte Belzung tafel- und stäbchenförmige Kaliumnitratkristalle bei Cucurbita Pepo intrazellulär in Glyzerinpräpa- raten. Im übrigen wirkt Salpeter in größerer Konzentration als Gift. Nach LiDFORSS verhindert er die Pollenschlauchbildung. Man vergleiche das Kapitel „Giftwirkung der neutralen Salze der Alkalimetalle in 0. Loews ,Ein natürliches System der Giftwirkungen'", p. 113—116. Beachtenswert erscheint auch die Beobachtung Retgers, wonach sich Kalisalpeter aus 206 Richter: Die Fortschritte der botanischen Milcrocheinie. XXU, 2. Nigrosin-haltigen Lösungen in violetten, stark dichroitischen Säulen ab- scheidet, während Kaliumsulfat mit Bismarckbraun faserige, stark dichroi- tische Kristalle liefert. Natrium Na. Mit dem Nachweise in der Pflanze hat man sich seit 1892 meines Wissens nicht beschäftigt, es bleiben daher die Proben mit Uran^'lmagnesium- acetat und Uranylacetat vorläufig die verwendbarsten. Nach H. Behrens werden von ihnen noch 0'8 beziehungsweise 04 Mikromilligramm Natrium angezeigt. 'ö' Ammonium NH(. Bezüglich der Reaktionen vgl. Z. M., p. 55 — 56. Nach Retgers Untersuchungen nimmt Ammoniumnitrat Indulin und Nigrosin auf, was für die Erkennung desselben unter andern Kristallen von Bedeutung sein kann. — • Vorkommen. Debski glaubt nach dem Verhalten des Zellsaftes der Marantaceen gegen Weinsäure auf NH^ oder eines seiner Alkyl -Substitutionsprodukte als die zu der vermutlich vor- handenen Äpfelsäure gehörige Base schließen zu sollen. Calcium Ca. Die gebräuchlichsten Fällungsmethoden der Mikrochemie zum Nachweise des Calciums sind die, welche zur Bildung von Calcium- sulfat, Calciumtartrat, Kalium-Calciumferrocyaiiid und Calciumoxalat führen. Davon erscheint die Schwefelsäureprobe am geeignetsten auch für mikrochemisch-botanische Zwecke. Zum Nachweise des Cal- ciums in Protei'nkörnerii benutzt Brien außer Schwefelsäure eine Lösung von oxalsaurem Ammon und Chlorammonium. Molisch wies mit Schwefelsäure geradezu Unmassen von Cal- cium im Milchsafte von Euphorbia Lathyris nach. Bei anderen Mileli- säften war ein starkes Schwanken bezüglich der Calciummengen zu bemerken. Das Calcium kommt in der Pflanze als Oxalat, Karbonat, Sul- fat, Tartrat usw. vor. Ich werde die seit 1892 bekannt gewordenen Vorkommen von Calciumverbindungen in der Pflanze in der Pieihen- folge von Z. M. besprechen. a) Calciumoxalat (COO).jCa. — Buscalioxi hat die Calciumoxalat- drusen einer eingehenden Untersuchung unterzogen. Den Körper ihres in- neren Hohlraumes hält er für harzartig. Mit dem Reagens von Unverdorben- Franchimont kann man einen starken grünblauen Niederschlag erzeugen, dessen Analyse einen Pektinstoff oder einen verwandten Körper, jedenfalls aber nicht Oxalsäure anzeigt. Der neue Körper wurde „Corpo mucilaginoso XXII, 2. Richter: Die Fortscliritte der botanisclien Mikrocliemic. 207 delle druse" genannt. Wittlin beliandelte aiisführlicli die Bildung der Kalkox;datt;ischen. Krasser gab die Mittel an, wie man im Aleuron leicht die Calciumoxalatdrusen erkennen könne. Es eignet sich das phosphor- saiire Xatron dazu wohl am besten. In den sogenannten „Ölplastiden" fand LiDFORSS Calciumoxalatkristalle. Ein P"'all des Vorkommens von gelöstem Calciumoxalat wird von Belzung gemeldet. Er fand nämlich bei den Samen von Lupinus albus Calciumoxalat, und zwar wahrscheinlich in loser Bindung mit Oxalsäure und Zitronensäure. Namentlich diese konnte er in großer Menge aus den genannten Samen isolieren. Das Calciumoxalat fällt beim Erhitzen aus dem eingedickten Extrakte der Samen in tetraedrischen Kristallen aus. Ich schließe die Aufzählung der Calciuraoxalatvorkommen mit dem Hinweise auf Wehmers Arbeit, in der er die Calciumoxalatnatur vieler Raphiden in Frage stellt und auf die Möglichkeit vom Vorhandensein von Kalkcitratraphiden aufmerksam macht. b) Calcium kar bona t COgCa. — Bekanntlich erscheint der kohlen- saure Kalk gewöhnlich als Merabraninkrustation. Fälle dieser Art sind neuerlich bekannt geworden. Rechixger beschrieb sie bei Haaren der Gesneriaceen und Mangin bei den Fruchthyphen und Sporangien der Mucorineen. Yexdo gab zur Entkalkung des Korallineenthallus die Pere- NYische Flüssigkeit an. c) Calciumsulfa t SO^Ca. — Nach Hansen kommt bei Angiopteris Gips in Form von großen Kristallen des monoklinen Systems vor. Schon Monteverde hatte die Richtigkeit dieser Angaben bestritten und die be- treffenden Kristalle für Calciumoxalat erklärt. Auch Belzung und Poi- RAULT kamen zu diesem Resultate. Belzung beobachtete übrigens die Bildung von Gipskristallen ge- legentlich seiner Studien über den Asparaginnachweis , wenn er die Schnitte in vollkommen reines Glyzerin gab. Die entstandenen Kristalle sind büschel- oder pinsel artig. d) Caiciumphosphat (P0.2).2(0,2Ca)3? — Re erwähnt Sphärite bei Agave americana , " die Kalk, Phosphor und organische Substanzen ent- halten. Zimmermann beobachtete Calciumphosphatausscheidungen in leben- den Zellen. Zur Prüfung auf Calcium wurde Schwefelsäure verwendet. Ließ man vor Zusatz der Schwefelsäure öprozentige Essigsäure auf die Präparate einwirken, so entstanden weniger Gipsnadeln. Überdies wurde lOprozentiges Ammoniumoxalat mit lOprozentiger Essigsäure zur Reaktion verwendet. Werden die Schnitte in dieser Lösung erhitzt, so werden die Sphärokristalle in Klumpen winziger Kristalle verwandelt, die in 5pro- zentiger Essigsäure gar nicht, in Salzsäure dagegen sehr leicht löslich sind. In einer Lösung von O'Aprozentigem Ammoniumoxalat und einpro- zentiger Essigsäure trat auch ohne Erwärmung die gleiche Erscheinung nach Verlauf einer halben Stunde auf. Bezüglich der Möglichkeit der Farbstoffaufnahme durch die von den Sphäriten eingeschlossenen Schleimkerne vergleiche das Kapitel „Phosphor- säure" und IL Fischers einschlägige Arbeit. e) Calci umpek tat. Mangin und Wille äußerten die Ansicht, daß die Mittellamelle aus Calciumpektat bestehe. Jüngst hat Devaux Beob- 208 Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. XXII, 2. achtungen gemacht, die ihn allerdings sehr zur Negierung dieser Maxgix- WiLLE sehen Ansicht aufmuntern konnten. (Man vergleiche das Kapitel „Pektinstoffe", Abschnitt „Mittellamelle".) f) Calcinmmalat und -malophosphat. — Belzüng und Poi- RAULT fanden bei Angiopteris evecta neutralen äpfelsauren Kalk. Bei zweimonatlichem Stehen des Saftes entstanden Sphärite von C'alcium mit einer noch unbekannten Säure. Belzung wies Calciummalo- und Calcium- phosphatsphärite in kaktusartigen Euphorbien nach. Über die Unterschei- dung beider vgl. das Kapitel „Apfelsäure". g) Calciumcitrat. — Wehmer beobachtete bei zwei Pilzen Bil- dung von Calciumcitratraphiden und konnte Calciumcitrat auch künst- lich zur Raphidenbildung veranlassen. Er vermutet deshalb, daß das, was man als Calciumoxalatraphiden beschrieben hat, sich oft als Raphiden der Zitronensäure herausstellen dürfte. Vgl. diesbezüglich das Kapitel „Zitronensäure". Nach alledem erscheint das Ca als jenes Element, das mit den meisten Säuren sich verbindet, die man als gewöhnlich für Pflanzen beschreibt. Magnesium Mg. Die bekannteste Reaktion auf Magnesium ist die, welche zur Bildung des Magnesiumammoniumphospliates führt. Sie hat sich auch anläßlich meiner Untersuchungen über das Magnesium in seinen Be- ziehungen zur Pflanze ^ heute noch als die geeignetste herausgestellt. Zu kontrollierenden Versuchen können Verwendung finden : 1) Arsenverbinduugen bei Gegenwart von Ammoniak. 2} Kaliumpyroantimoniat. 3) Seignettesalz mit Ammoniak. 4) Ferrocyankalium und Ammoniak. 5) Ammoniumoxalat und Essigsäure. 6) Ammoniumoxalat allein. 7) Oxalsäure und Zinksulfat. 8) Kaliumoxalat. 9) Schwefelsäure mit und ohne Wasser. Auszuscheiden sind die Reaktionen mit Natriumkarbonat allein, bei Gegenwart von Calcium, dasselbe bei Gegenwart von Phosphor, Oxal- und Essig-, Fluorwasserstoffsäure, Ammoniumfluosilikat und Uranylacetat. Sind die für die Bildung von Magnesiumammoniumphosphat not- wendigen Komponenten Magnesium und Phosphor in einem pflanz- ^) Zur Orientierung über die Kristallform und deren optischen Cha- rakter vergleiche man meine Untersuchungen über diesen Gegenstand. XXII, 2. Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. 209 liehen Objekte frei vorhanden, so kann man beide mit einem Schlage auch durch Ammoniak allein nachweisen : die Ammoniakreaktion. Brien wies auch das Magnesium der Proteinkörner mit Natrium- phosphat und ammoniakalische Chlorammoniumlösung nach. Vorkommen. Molisch führt als Beispiele starker Mg-Anhäufung au die Milchsäfte von Ficus elastica , Galactodendron utile und Eu- phorbia mammilaris. Eschbaum berichtet von Magnesiumammonium- phosphatkristallen in Agarabkochungen und führt deren Bildung auf Bakterien und Pilze zurück. Nach meinen Versuchen mit Gelatine glaube ich, ist der Gedanke zu erwägen, ob nicht die Austrocknung des Agars allein schon die drei zum Tripelsalz notwendigen Kom- ponenten zur Bildung des Magnesiumammoniumphosphates zu ver- anlassen vermag. Eisen Fe. Wie bekannt, haben Weiss und Wiesner Rhodankalium als Reagens auf Eisen in Form von unlöslichen Oxyd- oder Oxydul- verbindungen bei höheren Gewächsen angegeben ; für Eisen bei Algen in Form des Oxydhydrats war 10 Prozent Ferrocyankalium, dem etwas Salzsäure zugesetzt war, von Hanstein als sehr zweckmäßig erkannt worden. Molisch hat nun diese Reaktionen nachgeprüft und gefunden, daß auch für höhere Pflanzen Ferrocyankalium zum Nachweise am geeignetsten sei besonders wegen der lokalisierten Fällung von Ber- linerblau. Er empfiehlt eine 2prozentige Blutlaugensalzlösung und lOprozentige Salzsäure (bei 15'' C 4*9 Gewichtsteile HCl). Um die Lagerung des Eisens in toto festzustellen, wurden die Objekte, Samen etc. je nach Bedarf 1 bis 24 Stunden in verdünnter Blutlaugensalzlösung liegen gelassen. Das Kaliumferrocyanid zeigt Oxydsalze an. Bekommt man daher keine Reaktion mit diesem Reagens, so kann noch das Eisen als Eisenoxydulverbindung vor- liegen. Eine 2prozentige Ferricyankaliumlösung und 10 prozentige Salz- säure gibt darüber Aufschluß. Bekanntlich entsteht ein Niederschlag von Turnbullsblau innerhalb weniger ^Minuten. Man hat es daher in der Hand, sich jederzeit zu überzeugen, ob Eisen vorliegt 1) als Oxyd- (gelbes Blutlaugensalz), 2) als Oxydul- (rotes Blutlaugensalz), Zeitschr. f. wiss. Mikroskopie. XXII, 2. 14 210 Richter: Die Fortsclu-itte der butanischen Mikrochemie. XXII, 2. 3) als Oxyd-Oxydulform (gleichzeitige Behandlung einer Anzahl gleicher Objekte mit beiden Lösungen). Der große Vorteil liegt in der lokalisierten Fällung des Berliner Blaus, wodurch über die Verteilung direkt nachweisbaren Eisens in der PHanze sichere Schlüsse gezogen werden können. War mit den Reagentien und den mikroskopischen Schnitten kein Resultat zu erhalten, so wurde natürlich noch die Asche auf Eisen untersucht. Bei seinen Mitteilungen über das Eisen erwähnt Moliscii auch eine neue Reaktion auf das von ihm „maskiert" genannte Eisen. Läßt man rämlich Objekte, in denen mit den oben angeführten Reagentien das Eisen nicht nachgewiesen werden kann, Tage und Wochen oder Monate in einer gesättigten „reinsten" Kalilauge liegen , so färben sie sich nachher, mit Wasser ausgewaschen , mit den verwendeten Reagentien sehr deutlich und zeigen lokalisierte Farbenverteilang. Besonders auffallend war, daß Spirogyren, Holz- fasern etc., die, verascht, nicht eine Spur der Reaktion erkennen ließen, nach jenem Kalilaugen-Verfahren eine ganz ausgezeichnete Färbung zeigten. A. Meyer wies in seinem Referate darauf hin, daß reinste Baum- wolle die selbst in „reinster" Kalilauge des Handels vorhandenen Eisenspuren speichert und so nachweisbar macht. Molisch überprüfte nochmals seine Probe. Die neuen Experi- mente mit Fichtenholzspänen und Baumwolle ergaben die gleichen Resultate, woraus sich für den 3. Abschnitt des Molisch sehen Eisen- büchleius der Schluß ergibt: „Daß gewisse Zellen oder Teile derselben, z. B, die Globoide der Aleuronkörner usw. Eisen der Kalilauge zu entziehen und zu speichern vermögen, über die Verteilung des Eisens in der Pflanze selbst lehren sie (die Angaben des 3. Abschnittes nämlich) nichts." Und aus dem Reaktionsregister scheidet durch die Berichtigung von Molisch die Reaktion auf das „maskierte" Eisen aus. Meyer und Molisch hielten also die käufliche „reinste" Kali- lauge nicht für rein. Dagegen wendet sich Müller und behauptet, die Kalilauge sei wohl eisenfrei, durch das Stehen in den Glasgefäßen nehme sie aber Eisen aus dem Glase auf. Beweis : in Nichtglas- gefäßen bleibt die Lauge rein. Auch werde Eisen als Berlinerblau aus Blutlaugensalz durch Salzsäure abgespalten und mag so zu den Schnitten dazugekommen sein, denn selbst sehr stark verdünnte Säuren scheiden aus Blutlaugensalz allein Berlinerblau ab. Müllers Aus- XXII, 2. Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. 211 führnngen berühren somit bloß das „Wober" des „maskierten" Eisens und können als Bestätigung des obigen Zitates angesehen werden. Wie vorsichtig man bei einem Urteil über die Verteilung des Eisens sein muß , haben die Ausführungen bisher erwiesen. Darum wird man Petits Bemerkungen vom Eisen im Xuklein um so vorsichtiger aufnehmen müssen, als er auf Grund von makrochemischen Befunden allein zu dieser Ansicht gelangte. Macallum will im Zentralkörper der Cyanophyceen, freilich nicht stets streng lokalisiert, das Prisen nachgewiesen haben : Alkoholmaterial wird in Glyzerin und Ammoniumsulfat bei 60^ gehalten. Der Zentral- körper wird dunkelgrün. Schneller kommt man zum Ziel, wenn man Alkohol und Schwefelsäure, Ferrocyankalium und 0"5prozentige Salz- säure oder O'öprozentiges Hämatoxylin verwendet. Doppelfärbungen mit Umwandlung nach Preußisch Blau und Färbung mit Pikrokarmin lassen auch die Cyanophycinkörncheu hervortreten. — Welche von diesen Reaktionen als echte Eisenreaktionen angesehen werden können, ist eigentlich schon durch die Wiedergabe der Molisch sehen Unter- suchungen gesagt. Eng an die Molisch -Meyer sehen Befunde von der Eisen- speicherung seitens pflanzlicher Membranen schließen Devauxs Unter- suchungen über Pektinstoffe an , wonach letztere die Eigentüm- lichkeit besitzen das Eisen zu speichern ; Holzzellen speichern Eisen nur nach Behandlung mit Eau de Javelle. Membranen speichern Eisen noch aus Verdünnungen von 1 : 10 000 000. Nach später an- gegebenen Rezepten färbte Devaux Cellulose mit Eisenchlorid und Ferrocyankali blau, mit Kupferacetat und Ferrocyankali rot und mit Bleiacetat und Kaliumbichromat gelb , ebenso mit Eisenchlorid und Ammoniumsulfat. Mangan Mn. Nacli H. Behrens sind die geeignetsten mikrochemischen Reaktionen auf Mangan seine Füllungen als Oxalat, Ammoniummanganophosphat und Superoxyd. Besonders die zweite kann man nun, wie Gössl gezeigt hat, bei geeigneter Versuchsanstellung dazu benutzen, Mangan gleichzeitig neben Co, Ni, Fe und Mg nachzuweisen. Davon kommt bei der Pflanze besonders das Mg in Betracht. Man braucht nur die erzeugten MnNH^PO^ + öH.jO- Kristalle mit ~]j KMnO^ zu beliandeln, wobei sie sich braun färben. Die Fällung geschah in mikroskopischen Schnitten und aus Lösungen. Durch diese Gösse sehe Probe erscheint besonders für Untersuchungen an Pflanzen die Fällung als Manganamraoniumphosphat als derzeit beste mikrochemisch- botanische Reaktion auf Mangan, 14^ 212 Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. XXII, 2, Alle übrigen Arbeiten über diesen Stoff, die in den letzten Jahren er- schienen sind, haben sich bloß mit dem ernährungs-physiologischen, speziell stimulatorischen Werte dieses interessanten Elementes der Eisengruppe be- schäftigt oder sich der Giftigkeit desselben gewidmet. Von mikrochemischem Interesse ist das starke Anschwellen der Scheide der Eisenbakterien bei Manganfütterung, wie es Molisch nachgewiesen hat, und der Gallertschichte von Anthophysa vegetans, die unter denselben Be- dingungen von Adler gezogen wurde. Tonerde. Radlkofer entdeckte kieselsäuremassenähnliche Körper bei Symplocos- Arten. Man konnte sie mit Alizarin und Brasilin von den gleichzeitig vor- handenen Fettkörpern differenzieren, da sie sich intensiv färbten. Nach der Aschenanalyse hat man es hier mit Tonerde zu tun. II. Abschnitt. Org-anisehe Verbindungen [ausschließlich der Zellwandstoffe]. A. Fettreihe. 1. Alkohole. Bekanntlich hat Borodin den Dulcit in der Weise nachgewiesen, daß er auf die zu untersuchenden Objekte etwas Äthylalkohol gab, den er nach Bedecken mit dem Deckgläschen eindampfen ließ. Der vorhandene Dulcit kristallisiert so in großen prismatischen oder unregelmäßigen Kristallen aus. Monteverde hat dieselbe Methode sowohl für Dulcit wie für Mannit ver- wendet und die auskristallisierten Substanzen mit Borodins Methode der gesättigten Lösungen überprüft. 2. Aliphatische Karbonsäiiren. Ameisensäure. — Während Behrens zum Nachweise der Ameisen- säure Merkuronitrat verwendet, benutzt Czapek Sublimatlösung ; er erwärmt auf 70 bis 80 '', worauf sich ein weißer Niederschlag von Kali )mel bildet, der in Salzsäure unlöslich ist. Um nun Ameisensäure in den Zellen selbst nach- zuweisen, wurden Wurzelstücke in konzentrierter Sublimatlösung, die mit Wasser auf das fünf- bis zehnfache verdünnt war, im Wasserbade eine bis 2 Stunden lang erhitzt. Nach den notwendigen Reinigungen wird in einprozentiger Kalilauge gelinde erwärmt. In den formiatlialtigen Teilen XXII, 2. Richter: Die Fortschritte der botanischen Milirochemie. 213 tritt sofort Schwärzung auf (Niedersclüag im Protoplasma, niclit im Zell- saft und Zellkern). Oxalsäure. — Nachweis. Tritt nach Behkp:\s der Nachweis der Oxal- säure als Calcium- gegenüber dem als ötrontiumoxalat zurück, und wird er nur bei sehr verdünnten Lösungen empfohlen, die eine Einengung niclit vertragen, oder die man nicht einengen will, so spielt er in der botanischen Mikrochemie eine desto größere Rolle. Giessler hat ihn daher aucli ver- wendet, um die Verbreitung der Oxalsäure besonders in löslicher Form oder als Bioxalat im Pflanzenkörper festzustellen. Die Objekte wurden unter Anwendung der Luftpumpe mit einer Lösung von einem Teil Calcium- chlorid in drei bis vier Teilen Wasser injiziert, oder es wurde das Pflanzen- material direkt in eine kocliende Clilorcalciumlösung geworfen. Nach dem Auswaschen in Wasser war die Oxalsäure als Calciumoxalat in Form einer feinkörnigen kristallinischen Masse oder in der von Sphäriten zu sehen. Leider beeinträchtigten Gerbstoffe, die in stärkerer Konzentration als grau- schwärzliche oder bräunliche Massen niedergeschlagen werden, sehr stark die Reaktion. Vorkommen. Nachdem ich bereits bei der Besprechung des Calcium- oxalats der Arbeiten von Buscalioni, Belzing und Poirault, Krasseii, WiTTLiN, LiDEORSS und Belzung gedacht habe, möchte ich hier noch auf die letzte genauer eingehen. Es gelang Belzung Calciumoxalat im Zustande der Lösung im Samen von Lupinus albus nachzuweisen. Nach seiner Meinung dürfte es da in loser Bindung mit Oxalsäure und Citronen- säure vorkommen. Dickt man nämlich unter Erhitzen das wässerige Extrakt ein, so fällt das Calciumoxalat in Form tetraedrischer Kristalle aus. — Wehmers Verdacht von der Calciumcitratnatur vieler Raphiden wurde oben schon erwähnt. Äpfel säure. — Indem ich kurz auf den Nachweis der Äpfelsäure als Silbermalat oder durch Überführung in Malein- und Fumarsäure verweise, gehe ich gleich auf die mir bekannt gewordenen Fälle charakteristischen Vorkommens die&er Säure ein. In kaktusförmigen Euphorbien erkannte Belzung die schon mehrfach untersuchten Fällungen durch Alkohol teils als Calciummalophosphat, teils als Calciummalat. Jenes bildet Sphärite, die zunächst amorph erscheinen und später eine radiäre Struktur annehmen, dieses prismatische zu Sphäriten geordnete Kristalle. Beide werden am besten mit TOprozentigem Alkohol erhalten. Die Kristalle konnten auch aus künstlich dargestelltem Calciummalophosphat mit Alkohol erzeugt werden. Durch Debskis Untersuchungen wurde das Vorhandensein von Äpfelsäure in den Blättern und Blattstielen von Marantaceen sehr wahr- scheinlich. Vgl. schließlich den Abschnitt über Calciummalat (oben p. 208). Citronensäure. — Der Nachweis der Citronensäure erfolgt wieder am günstigsten durch Silbernitrat. Das Calciumcitrat hält Behrens für mikroskopische Erkennung für völlig wertlos. Wegen seiner Unlöslichkeit in Wasser ist es aber zur Trennung der Citronensäure von flüchtigen Säuren von großer Bedeutung. Dieser Umstand kam nun Wehmer bei seinen Studien der von zwei verschiedenen Hyphomyzeten ausgeschie- denen Calciuracitrate sehr zustatten. Die Pilze wurden in mit Kreide ver- setzter Zuckerlösung kultiviert. Das Calciumcitrat wurde durch Erwärmen 214 Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. XXII, 2. nachgewiesen, dabei füllt es sofort in Form von Raphiden- und Sphärit- ähnlichen Körpern aus. Wehmer vermutet daher, daß vielleicht viele der bisher für Oxalatraphiden gehaltenen Kriställchen Kalkcitratraphiden seien. — Mit Oxalsäure zusammen ist die Citronensäure im Lupinensamen von Belzung gefunden worden. Milchsäure. — Die Milchsäure habe ich an den Schluß meiner Aus- führungen über nicht flüchtige aliphatische Karbonsäuren gestellt, weil sie stets nur als mikrotechnisch wichtig genannt wird. Krasser hat ihr deshalb geradezu eine Abhandlung gewidmet. Seither empfahl sie Lager- HEiii mit Jod zum Stärkenachweis und Klebahn fand sie bei der Unter- suchung von Herbarmaterial von Rostpilzen in Übereinstimmung mit Lager- heim vorzüglich geeignet. 8. Aldehyde. Bei der Frage nach dem Vorhandensein von Aldehj'den handelt es sich gewöhnlich darum , quantitativ den Aldehydgehalt der Blätter fest- zustellen, um Stützen für die Bayer sehe Assimilationshypothese zu ge- winnen, also um rein physiologisch-chemische Probleme, die somit über den Rahmen dieses Referates hinausgehen. Man vgl. diesbezüglich Bokornys „Über Stärkebildung aus Formaldehyd" und Reixkes und Braunmüllers „Untersuchungen über den Einfluß des Lichtes auf den Gehalt grüner Blätter an Aldehyd". Pollacci bringt neue Angaben betreffend den Nach- weis des Formaldehyds in grünen assimilierenden Pflanzenteilen, besonders über die Farbenreaktion mit Codein und Schwefelsäure, doch spricht er nicht von ihrer mikrochemischen Verwendbarkeit. 4. 01.^ Unterscheidung von fettem und ätherischem Öle. Bisher war A. Meyers Methode der Unterscheidung- von ätherischen und fetten Ölen wohl zumeist im Gebrauche. Da bei der Auf- bewahrung der Objekte im Brutschrank bei 130^ das ätherische Öl abdampft, hat man nachher eigentlich bloß die fetten Öle vor sich. Es muß somit als ein Fortschritt betrachtet werden, daß uns Mesnard mit einer Methode bekannt macht, die direkt unter dem Mikroskope die beiden so häutig vorkommenden Formen des Öles zu unterscheiden gestattet. Zu diesem Zwecke nimmt man eine feuchte Kammer mit zwei konzentrischen Ringen und gibt in den inneren Kreis Glyzerin mit Zucker , darauf die Schnitte , in den Hohlring aber rauchende *) Man vergleiche auch Biermann, R., „Über Bau- und Entwicklungs- geschichte der Olzellen und die Ölbildung in ihnen." Inaug.-Diss. Berlin 1898. XXII, 2. Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. 215 Salzsäure. Unter diesen Bedingungen kann man bemerken, daß sich das flüchtige Ol in goldgelbe Tröpfchen zusammenballt, die später verschwinden, während das fette Öl unverändert erscheint. Wie gut diese Methode zu sein scheint, erhellt daraus, daß man bei Orangen- blüten mehrere ätherische Öle unterscheiden kann , was theore- tisch den Schluß gestattet, daß ihr Geruch ein zusammengesetzter sein muß. Bei seinen Studien über die Lokalisation der fetten Öle während der Keimung versuchte Mesnard noch eine passende Verbesserung seiner Methode, und zwar mit gutem Erfolge. Nach Belassung der Präparate in Salzsäuredämpfen während 2ö — 30 Stunden, während welcher Zeit das ätherische Öl zerstört wurde, und der Zellinhalt auf einen Tropfen zusammengezogen war, wurden durch 2 Sekunden hin- durch Joddämpfe einwirken gelassen. Dadurch tritt Gelbfärbung des fetten Öles ein, wodurch es sehr deutlich und zum Messen geeignet wird. Aus der Größe des Durchmessers wurde die enthaltene Öl- menge berechnet. Es konnte auf diese sinnreiche Weise gezeigt werden, daß sich die erhaltenen Zahlen nach Tageszeit, Belichtung und Entwicklungszustand ändern. Danach zeigen also beide Arten von Öl Tropfenbildung in Salz- säuredämpfen, doch das ätherische sofort, das fette erst nach etwa einem Tage, wodurch die Möglichkeit gegeben ist, leicht die beiden Formen zu unterscheiden. Eine solche Methode erscheint um so wertvoller, als erst in der jüngsten Zeit Tschirch gezeigt hat, daß die Methode, durch Er- hitzen des Präparates eine Unterscheidung beider Öle möglich zu machen, nie einwandsfrei ist. Selbst bei 100 bis 110^ verflüchtigen sich nicht alle ätherischen Öle. Die höher siedenden Terpene und Polyterpene zum Beispiel, und viele andere Öle verharzen bei der Erhitzung. Auch ist angeblich keines der vorhandenen Reagentien der fetten Öle zur Unterscheidung von Ilarzbalsam verwertbar. Ölkörper der Lebermoose. Passend dürften sich hier auch die Methoden zur Unterscheidung der Ölkörper der Lebermoose von den fetten und ätherischen Ölen anschließen. Nach den bekannten Untersuchungen von Pfeffer hat sich besonders v. Küster dem Studium der Ölkörper gewidmet und eine vielfache Übereinstimmung ihrer Keak- tionen mit den der fetten und ätherischen Öle gefunden. Andrews hat später die mechanische Trennung durch Zentrifugalkraft zu Hilfe genommen, die die Ölkörper infolge einer in ihnen vorhandenen spezifisch schwereren Substanz stets in das zentrifugale Zellenende 216 Richter: Die Fortschritte der botanischen Mikrochemie. XXII, 2. schleuderte. Die neuesten diesbezüglichen Angaben rühren vou Loh- mann her. Danach sind die Ölkörper 1) Löslich in Petroläther, Äther, Aceton, Chloroform, Benzol, Schwefelkohlenstoft", Nelkenöl, starkem Alkohol, aber auch verdünntem Alkohol (noch in bis 40prozentigen), Eisessig und Chloralhydratlösung. 2) Kalilauge und Säuren lösen nicht; wohl kann es bei der Ein- wirkung von Kalilauge geschehen, daß die Ölkörper plötzlich ver- schwinden, aber eine Verseifnng in der Weise, daß erstarrte Seifen- massen sichtbar werden, tritt sogar bei vorhergegangener Kochhitze nicht ein. o) Durch Osmiumsäure, Alkanna und verschiedene andere Farb- stoffe färben sie sich leiclit. Es ist somit die Verseifungsmethode, die sicherste zur Differen- zierung der Ölkörper von fetten und ätherischen Ölen. Auch Garjeanne hat neuerdings eine interessante Arbeit über die Ölkörper der Jungermanniaceen veröffentlicht, die sich mit Ent- wicklungsgeschichte , Lage , Bewegungserscheinungen , Vermehrung, Bedeutung und Vorkommen der Ölkörper beschäftigt. Für die ent- wicklungsgeschichtlichen Studien hat sich eine konzentrierte wässerige Pikrinsäure als zweckmäßig erwiesen. Die Hülle der Ölkörper, auf die auch schon Küster aufmerksam gemacht hat, besteht nach Gar- jeanne wahrscheinlich aus gerbsaurem Eiweiß. Fettes Öl. — Unter den F e ttr eagentien spielen, wie be- kannt, die Farbstoffe Alkanniu und Cyanin eine große Rolle. Nachdem Rosenthal die Verwendbarkeit von Sudan III für den Fettnachweis dargetan hatte, bürgerte es sich für diese Zwecke bald ein. Man ver- gleiche BuscALioNi, der das Reagens in die botanische Mikrotechnik eingeführt hat, B. Fischer, Herxheimer und Kohl. Dagegen äußert sich Lewinson abfällig über den Farbstoff ebenso wie über die Osmium- säure. Er gibt für tierhistologische Zwecke eine Methode au, die in der Einwirkung von Müller scher Flüssigkeit, Kaliumhyperman- ganat, Oxalsäure und schwefligsaurem Kalium besteht. Zu Kontrast- färbungeu sollen besonders Karminlösungen bei Naclibehandlung mit Säurealkohol und gesättigter Pikrinsäure und Einbetten in Kanada- balsam geeignet sein. Dadurch wird das Fett dunkelblau, fast schwarz, die Kerne rot und das Protoplasma gelb. Vielleicht ließe sich mit passenden Änderungen dieses Verfahren auch auf pflanz- liche Objekte anwenden. Auch andere Farbstoffe sind noch empfohlen worden: Scharlach R von Lagerheim zum Nachweise fremden Fettes in der Schokolade , und von B. Fischer , Alizarin und Brasilin von XXII, 2. nicht er: Die Fortscliritte der botanisclien Mikrochemie. 217 Radlkoper, und Prodigiosin von Rosenberg. Kohl endlich gibt an, daß mittels Dimethylamidazobenzol Fett gelb gefärbt wird. Es ist interessant, zu hören, welches Ergebnis eine kritische Untersuchung dieser zahlreichen Methoden des (Jlnachweises ge- zeitigt hat. Eine solche danken wir Hartwich und Uhlmann, die den Beweis erbrachten , daß alle hinter der Fettverseifungsmethode von MoLiscii zurückbleiben, da mit ihr nicht nur das Öl an und für sich, sondern sogar die Natur des fetten Öles unter dem Mikroskope festgestellt werden kann , wenn man nämlich Kristallform und Zeit- dauer der Kristallisation bei der Beurteilung zu Hilfe nimmt. Bezüglich der Kristallbildung in Öltropfen sei auch auf Bertrand und PoiRAULT verwiesen, die in Glyzerineinschluß in Öltropfen Kristalle entstehen sahen, welche Fett oder Cholesterin sein mochten, und auf Kohl, der bei Behandlung von Schnitten durch die Blütenblätter von Silphium perfoliatum, Calendula offic. und Gazanea splendens mit alkoholischer Kalilauge Phytosterinsphärite erhielt. Man bekommt sie auch bei Behandlung granaführender Leukoplasten aus der Epi- dermis der Agave americana oder dem Stengelparenchym von Equi- setum arvense. Lösung. Bekanntlich (Z. M. p. 87) erscheint nach genaueren Untersuchungen über die Löslichkeitsverhältuisse von Ölen auch der Eisessig als vorzügliches Lösungsmittel. Davis nutzte nun diese Er- fahrung mit bei Verwendung von Chromessigsäure als Fixierungsmittel fett- und ölreicher Zellen aus, denn bei Anwendung dieser Säure er- halte man die Zellen möglichst frei von Fett und Öl, vgl. diesbezüglich auch Lohmann 1.